α-淀粉酶抑制剂能有效地与α-淀粉酶结合形成酶-抑制剂的复合物,使α-淀粉酶活性丧失或降低来阻碍食物中碳水化合物的水解和消化。α-淀粉酶抑制剂可以作为防治和治疗高血糖、糖尿病及高血脂等疾病的药物,也可以应用于日常生活中保健,控制饮食,减少肥胖;同时α-淀粉酶抑制剂基因及产物对农业昆虫防治和减少杀虫剂使用、保护生态环境有重要的应用价值。植物来源蛋白类α-淀粉酶抑制剂分为六类:Kunitz-like、Knottin-like、Cereal-like、Lectin-like、γ-Purothionin-like 和 Thaumatin-like。鹰嘴豆(Cicerarietinum L),属于豆科鹰嘴豆属,是以谷物为主食的亚洲南部、西部、东部和非洲北部人类的主要蛋白质来源,目前鹰嘴豆在豆科作物中居第3位,是栽培面积较大的食用豆类作物之一。本项目组前期工作中通过硫酸铵分级沉淀(ASP)、离子交换色谱(IEC)以及反相液相色谱(RPLC)从鹰嘴豆种子中成功分离纯化获得一新型贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂,本文在此基础上,从高α-淀粉酶抑制活性鹰嘴豆种质的筛选、α-淀粉酶抑制剂分离纯化的优化、基因克隆、原核表达、抑制活性相关结构域分析、体内合成途径与抑制活性的变化及生物学特性方面对鹰嘴豆种子中新(贮藏蛋白)类型α-淀粉酶抑制剂进行了研究,以揭示该抑制剂生物学活性以及表达调控的分子机制。其主要研究结果如下:1.分别比较了不同品种鹰嘴豆种子粗提液及硫酸铵沉淀的α-淀粉酶抑制活性,筛选具有较高α-淀粉酶抑制活性的鹰嘴豆种质资源,其中W4中抑制活性高于品种W2,选择总体抑制活性较高的Kabuli型(W2)和Desi型(W4)作为鹰嘴豆中α-淀粉酶抑制剂蛋白分离纯化的材料。W2具有较高抑制活性的硫酸铵沉淀蛋白60%-80%和80%-100%合并后用于离子交换色谱,有7个蛋白峰被洗脱下来,其中峰P4具有较高抑制活性(54.54%);峰P4用于高效液相反相色谱,有3个蛋白峰被分离,其中峰PⅢI有最高抑制活性(80.85%),峰PⅢ经质谱与蛋白数据库比对,鉴定出3条肽段序列与豌豆(Pisumsativum)Albumin-2蛋白相符合,识别为鹰嘴豆中植物凝集素蛋白CL-A2(gi|625987)。W4具有较高抑制活性部分60%-80%和80%-100%分别用于离子交换色谱,其中ASP(60%-80%)有5个蛋白峰被洗脱,峰P1.1与峰P1.2具有较高抑制活性(为81.16%、50.72%);ASP(80%-100%)有5个蛋白峰被分离,其中峰P2.4具有较高抑制活性(65.24%);将离子交换色谱分离的具有较高活性的部分合并后分别用于高效液相反相色谱,ASP(60%-80%)有4个峰被进一步分离,其中峰III和峰IV的抑制活性较高(75.93%、81.48%),经分析峰III和峰IV中都有一蛋白大小约为60kDa,而峰IV中存在另一蛋白,大小约为25.0kDa;ASP(80%-100%)有5个峰被进一步分离,其中峰I、峰IV和峰V都具有较高的抑制活性(60.38%、71.70%、60.38%),分析各活性峰中存在一分子量约为60kDa的蛋白;将ASP(60%-80%)和ASP(80%-100%)蛋白经反相色谱分离纯化到的具有较高抑制活性的两种蛋白(蛋白A:25 kDa和蛋白B:60 kDa)进行酶解后,用质谱检测搜索比对数据库,蛋白A识别为鹰嘴豆中植物凝集素蛋白CL-A2(gi|625987),与W2纯化鉴定结果一致;蛋白B中鉴定出两个肽段R.DFLEDALNVNR.R和K.SEGGLIETWNPSNK.Q,与鹰嘴豆球蛋白Q9SMJ4相符合,与实验室前期工作结果一致,比较蛋白分子大小,推测我们纯化到的鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂蛋白CL-AI为鹰嘴豆球蛋白Q9SMJ4的前体蛋白。2.克隆了鹰嘴豆中贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂蛋白CL-AI与CL-A2的基因序列,其中CL-AI基因ORF全长1491 bp,编码497个氛基酸;CL-A2基因ORF全长为693 bp,编码231个氨基酸;经与DNA序列比较分析表明CL-AI基因由4外显子序列组成,而CL-A2基因中不含有内含子序列。生物信息学分析发现,CL-AI基因与豌豆、野豌豆、首蓿、大豆等作物中基因序列表现出很高的相似性,CL-AI蛋白在结构中α-型螺旋占28.97%、β-型结构占11.07%、延伸链占有21.53%、无规则卷曲占有38.43%;N端存在一长度为21氨基酸的信号肽序列,其被信号肽酶酶切位点位于21号与22号氨基酸之间,预测主要分布在蛋白分泌通路(SP)中;超二级结构中包含有两个RmlC-likecupin结构域,并将其分类为11S种子贮藏蛋白。CL-A2基因与豌豆、苜蓿、菜豆等作物中基因序列相似,CL-A2蛋白二级结构中α-型螺旋占27.83%、β-型结构占有16.52%、延伸链占26.09%、无规则卷曲占有29.57%;其不存在信号肽序列,亚细胞定位于细胞质中;超二级结构主要构成一个Hemopexin-likedomain结构域,并根据结构域将其归为Lectin-like蛋白。3.将去除信号肽CL-AI和CL-A2的ORF序列,以及编码CL-AI蛋白亚基CL-AI-α和CL-AI-β序列分别插入到原核表达载体中,并转入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过优化表达条件诱导蛋白表达并用Ni柱亲和层析分别获得了 CL-A2、CL-AI、CL-AI-α的可溶性融合蛋白以及CL-AI-β包涵体融合蛋白,并将CL-AI-β包涵体蛋白进行了体外蛋白复性。分别测定各纯化的原核表达融合蛋白对人唾液淀粉酶(HSA)的抑制作用,结果表明CL-A2、CL-AI、CL-AI-α、CL-AI-β蛋白对HSA都有一定的抑制作用,抑制活性分别为56.47%、67.06%、70.59%、67.65%,相互之间活性差异不显著。4.CL-AI蛋白保守结构域Cupin缺失原核表达实验结果表明CL-AI蛋白α链与β链Cupin结构域的单个缺失使其对人唾液淀粉酶(HSA)抑制活性下降(36.90%、44.51%),差异显著;CL-AI蛋白内Cupin结构域的全部缺失使其蛋白抑制活性显著降低(1.42%),基本失去抑制活性。对CL-AI-α蛋白氨基酸点突变试验结果表明Gly75位点突变使CL-AI-α蛋白抑制活性显著降低,其抑制活性仅保留有0.90-7.69%;Pro123突变使CL-AI-α蛋白在低浓度(0.08吨/μL)时,对HSA的抑制作用呈显著性降低,但仍然保持有活性(38.91%),并且随着蛋白浓度的增加,其对HSA的抑制作用呈上升趋势,高浓度(0.24 μg/μL)的CL-AI-α突变蛋白的抑制活性显著性高于对照组(47.96%);Asn132突变及Pro123、As132双突变对CL-AI-α蛋白抑制活性的影响与Pr0123突变相似,说明Cupin结构域中第一保守区域中的保守氨基酸Gly75对CL-AI-α蛋白抑制活性起重要作用;而第二保守区域中保守氨基酸Pro123和Asn132的突变会改变CL-AI-α抑制活性的酶学特性。选择克隆序列差异而结构相似的大豆蛋白Glycinin G1和水稻蛋白Glutelin,进行原核表达并纯化获得融合可溶性蛋白Glycinin G1和包涵体蛋白Glutelin,然后将包涵体进行复性;其对HSA抑制活性测定结果表明Glycinin G1和Glutelin对HSA都有一定的抑制作用,推测Glutelin和Glycinin G1蛋白与CL-AI蛋白在3D结构上具有类似Cupin结构域,因而在功能上表现出与CL-AI类似的生物学活性。5.体外蛋白二硫键重建试验结果表明CL-AI和CL-AI-β蛋白自身能够但不易于形成二硫键,且二硫键的形成可以一定程度提高其对α-淀粉酶的抑制活性;与CL-AI和CL-AI-β相比,CL-AI-α蛋白自身更易于二硫键重建,使其抑制活性降低;CL-AI(α+β)倾向于与CL-AI-α、CL-AI-β形成二硫键,形成的二聚体抑制活性出现明显降低;CL-AI和CL-AI-β蛋白之间形成二硫键的能力最强,同时也造成了蛋白抑制活性的明显下降;综合表明了 CL-AI(α+β)、CL-AI-α和CL-AI-β蛋白之间二硫键的形成直接造成了蛋白α-淀粉酶抑制活性的降低。6.CL-AI基因转录水平的研究表明,种子发育过程中,CL-AI基因在转录水平上转录成编码CL-AI前体蛋白的单一 mRNA,不存在编码其他蛋白的通路,其mRNA也没有发生可变性剪切为编码α链和β链的mRNA。CL-AI基因翻译水平的研究表明CL-AI前体蛋白在去除信号肽和被剪切为CL-AI-α和CL-AI-β两肽链后,这两肽链之间通过二硫键的形成而结合为异源二聚体贮藏在体内;二硫键的形成发生在CL-AI被剪切为两肽段之后,而不是在CL-AI前体蛋白未被剪切前。CL-AI蛋白亚细胞定位结果表明,CL-AI蛋白主要在细胞质中合成,随着合成蛋白逐渐积累,其被转运到蛋白质贮藏型液泡中。综合揭示了鹰嘴豆贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂CL-AI在植物体内合成途径并表明CL-AI前体蛋白及剪切而成的α和β亚基在蛋白合成过程中保持有活性,但两亚基之间二硫键使其组装为二聚体后,其抑制活性降低甚至消失。7.原核表达纯化蛋白CL-AI-α蛋白对来源于人唾液(HSA)、猪胰腺(PPA)、玉米(MA)、枯草芽孢杆菌(BA)、米曲霉(OA)的α-淀粉酶都有一定抑制作用,其抑制率分别为 71.58%、74.32%、67.74%、53.45%、71.11%。CL-AI-α 蛋白抑制活性主要受温度影响,并具有一定的热稳定性;最适应的pH值范围为7.0-9.0,共培养时间和底物淀粉浓度也会影响其抑制活性;随着蛋白浓度的升高,CL-AI-α蛋白对各种α-淀粉酶抑制活性逐渐降低。CL-AI-α蛋白对棉铃虫幼虫中肠和血液中α-淀粉酶有较强抑制作用,抑制活性分别为68.42%、96.21%,对唾液中淀粉酶抑制活性为39.09%;CL-AI-α蛋白对马铃薯甲虫幼虫中肠淀粉酶抑制活性最强,为55.26%,对唾液淀粉酶抑制活性为28.71%,对血液中淀粉酶基本无抑制作用;马铃薯甲虫幼虫饲喂试验表明饲喂CL-AI-α、CL-AI及CL-AI(R)蛋白的马铃薯幼虫体重没有增加反而略有减轻,体重分别减轻了 4.38%、0.83%和7.77%,而饲喂CL-AI-β蛋白的幼虫体重略有增加,其增加率仅为0.91%,而对照组体重增加了 50.62%。CL-AI-α蛋白对小麦、水稻、玉米种子发芽影响的试验表明CL-AI-α蛋白对三种作物种子的发茅率影响不明显,对发芽后干重和鲜重影响不明显,但减慢了根长和芽长的生长速度,延缓了种子发芽后的生长发育。