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本研究通过针对海南岛番木瓜发病情况进行采样调查,进一步确认了番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)仍然是目前严重危害海南地区番木瓜生产的主要病害,严重制约着番木瓜产业的发展,给农民带来巨大的经济损失。常规的田间管理或栽培措施对病毒控制的效果较差或者成本较高,防治PRSV最直接有效的措施是种植抗病品种,目前商业化种植的主要抗病品种都是转基因品系。但是通过我们的调查发现,现有的转基因品系己经对PRSV的一些株系表现出抗性减弱,甚至不抗的现象。近几年发展起来的CRISPR技术提供了新的抗病毒策略。我们通过与美国明尼苏达大学Dan Voytas实验室合作,在本实验室建立起了用golden gate法构建CRISPR基因编辑载体的体系,构建了两套基因编辑载体。(1)将编辑DNA双链的CRISPR/Cas9系统进行了改造,用FnCas9替换了 Cas9的CRISPR/FnCas9系统可以识别切割RNA。本研究对病毒不同株系和不同基因的保守区域进行分析,并设计了多个不同的gRNA,串联到植物转化表达载体中,可以对不同株系的病毒进行识别并切割其RNA,真正达到广谱抗PRSV的目的。(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑系统突变番木瓜中表达与PRSV VPg蛋白相互作用对病毒复制起关键作用的eIF4E类蛋白的基因,有望在不影响番木瓜自身功能的情况下,阻断植株与病毒的相互作用,使病毒不能复制,由此使植株获得可遗传抗性。抗番木瓜环斑病毒的CRISPR/FnCas9基因编辑载体pCRISPR-FP-FnCas9经过在番木瓜叶片上的局部瞬时表达实验验证,显示了初步的病毒控制效果。目前正同另外一套测序验证过的对番木瓜基因组中eIF4E基因进行编辑的CRISPR/Cas9基因编辑植株转化载体pRLG103-PeIF4E-ET 一起进行番木瓜的遗传转化工作,转化后的愈伤组织已经进入抗性筛选阶段。