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奥希替尼(osimertinib,AZD9291)是第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition,EGFR-TKI),临床上用于治疗选择性靶向T790M突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)晚期患者。尽管AZD9291靶向性强、疗效好,但对于患者来讲服用成本高、且易产生耐药和副作用。一般认为纳米药物递送系统可以增强药效、减少给药量,因此,本研究旨在设计构建基于聚乳酸羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)的多功能、可控制备和释放的AZD9291纳米给药系统,以提高AZD9291利用率和药效,为其进一步作为AZD9291转运载体提供技术支持。首先,建立并优化了纳米粒的制备工艺,对纳米粒的理化性质进行评价。以分子量为17000 Da的PLGA作为基材,通过超声乳化-溶剂蒸发法包载AZD9291形成AZD-PLGA纳米粒(AZD-PLGA NPs),再采用低分子量壳寡糖对AZD-PLGA NPs表面进行修饰,得到AZD-PLGA纳米粒(AZD-PLGA-COS NPs),通过正交试验,优化制备条件,结果显示:PLGA浓度为10 mg/mL,超声强度为97.5 W,壳寡糖浓度为5.0 mg/mL,内水相/外水相的体积比为1:8,制备的AZD-PLGA-COS NPs粒径为176.6±0.4 nm,PDI为 0.186±0.022,电位为 18.65±0.38 mV,包封率达 95.22±0.49%,较 AZD-PLGANPs粒径减小,电位大幅增加、包封率提高。纳米粒在电镜下观测呈近球形,并且在药物释放过程中,AZD-PLGA-COS NPs随着释放时间延长逐渐地释放AZD9291,具有一定的缓释性。AZD-PLGA NPs和AZD-PLGA-COS NPs在不同温度下储存15天仍保持较均一的粒径,并在72 h内能够抵抗血清诱导的聚集,稳定性良好。其次,研究了纳米粒的生物相容性和使用过程安全性。采用MTT法对空白纳米粒的细胞安全性进行评价,结果表明:在50-800 μg/mL范围内,空白PLGA NPs、空白PLGA-COS NPs对L929、H1975细胞影响较小,说明其细胞相容性良好;对空白纳米粒的溶血率进行定量分析,空白PLGA NPs和空白PLGA-COS NPs的溶血率都低于1%,未出现溶血现象;空白PLGA-COS NPs在壳寡糖的修饰后,复钙时间更接近空白血浆的复钙时间,这说明壳寡糖的修饰可提高纳米粒的抗凝血能力,改善纳米粒的血液相容性。最后,通过细胞摄取、细胞毒性、细胞凋亡等对纳米粒进行体外药效学评价。制备了包载Cy3荧光染料的纳米粒,通过荧光显微镜对细胞摄取结果进行观察,H1975细胞中Cy3@PLGA-COS NPs的平均荧光强度比Cy3@PLGA NPs更强,在流式分析中也得到了一致的结果,说明纳米粒在经过壳寡糖的表面修饰后能够增强细胞摄取。H1975细胞存活率实验表明:经 AZD9291、AZD-PLGA NPs、AZD-PLGA-COS NPs 处理 72 h 后,H1975 细胞的 IC50 分别为 88.68±3.79 nM、75.15±2.21 nM 和 47.98± 0.99 nM,AZD-PLGA-COS NPs组的IC50显著下降。这个结果也在细胞凋亡实验中得到验证:AZD-PLGA-COS NPs处理后H1975细胞的晚期凋亡率为38.09±1.40%,明显高于AZD9291(23.54±0.82%,p<0.001)和 AZD-PLGANPs(30.41±0.92%,p<0.01)。Western blot结果发现,纳米粒通过调控凋亡相关蛋白的表达,诱导H1975细胞凋亡。因此AZD-PLGA-COS NPs通过促进细胞摄取、提高胞内药物浓度、调控内源性蛋白、诱导细胞凋亡达到增强药效的效果。同时,在研究中发现壳寡糖具有抑制PD-L1 mRNA及蛋白水平的表达的作用,并能够显著下调因AZD9291促进的PD-L1表达。AZD-PLGA-COS NPs同样能够抑制H1975细胞中PD-L1在mRNA、蛋白水平的表达,表明壳寡糖在作为载体材料的同时还发挥了免疫调节的作用。研究结果表明,AZD-PLGA-COS NPs有望成为“靶药-免疫”双效治疗平台。