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目的:以糖尿病模型大鼠为研究对象,以中医温润通络为法,通过观察各组大鼠血糖、坐骨神经电生理改变及坐骨神经醛糖还原酶(AR)、Na+-K+-ATP酶、山梨醇活性变化,探讨中药温润通络方对其影响,阐明其防治糖尿病周围神经病变(DPN)的部分作用机制,为温润通络方的临床应用提供实验依据,促进中医药的发展。
方法:选取健康的、体重200g-230g之间SD雄性大鼠60只用于实验。大鼠喂养于18℃~22℃清洁的动物实验室内。正常喂养一周后,随机抽取10只大鼠作为正常对照组(简称正常组,normal group),其余50只采用链脲佐菌素腹腔注射造模法造模。将大鼠禁食12h后,腹腔注射1%链脲佐菌素柠檬酸缓冲液(柠檬酸缓冲液为0.1mmol/L,pH值4.5),按照50mg/kg腹腔内一次注射,72小时后,取尾尖血测定血糖值,凡血糖值大于16.7mmo/L者纳入实验。正常组的10只大鼠在禁食12h后一次性腹腔注射相等容积即0.1mmol/L的柠檬酸缓冲液。将造模成功的大鼠随机分为4组:模型对照组(简称模型组,model group),血府逐瘀汤组(简称对照组,contrast group),温润通络方高剂量组(简称高剂量组,high-dosegroup),温润通络方低剂量组(简称低剂量组,low-dose group)。每组10只。高剂量组大鼠给于温经通络方灌胃,药量按34g/kg·d;低剂量组大鼠给于温经通络方灌胃,药量按17g/kg·d;对照组大鼠给于血府逐瘀汤灌胃,药量按25.6g/kg·d,以上3组灌胃按1ml/100g计算容量,每天上午1次。正常组和模型组给予等体积生理盐水,每天上午灌胃1次。各组分别灌胃8周,自由进食水,观察各组大鼠的神态、体毛、活动、摄食饮水量、尿量等一般情况,然后麻醉固定大鼠测定其神经传导速度和潜伏期。于最后一次灌胃24h后取血用葡葡糖氧化酶法测量血糖。剖取坐骨神经脱水、切片、HE染色,观察其形态学变化。同时分别利用荧光分光光度法、比色法和化学法测定AR、Na+-K+-ATP酶和山梨醇的表达情况。
结果:
1.各组大鼠的一般情况
实验前,各组大鼠一般情况良好。实验期间,模型组大鼠表现为精神倦怠,毛发枯黄,活动减少,出现多饮多尿的症状,且尿液较粘,2周后这组大鼠摄食量明显增多。随着时间的延长,与正常组相比较,模型组大鼠多饮多食多尿症状显著,体重增加缓慢后期逐渐减轻。与模型组比较,温润通络方高、低剂量组和血府逐瘀汤对照组的大鼠“三多”症状逐渐好转,体重增加,精神状况、自主活动也有明显改善,其中,高剂量组的大鼠在各方面改善最为明显,外观、精神、饮食、摄水、尿量等和正常组较接近。对照组大鼠同样存在多饮多食,多尿,体重增加,精神不振等症状。与模型组比较,症状减轻。
2.血糖情况
与正常组相比,模型组大鼠血糖明显升高,具有明显统计学意义(P<0.01);高剂量组、低剂量组大鼠血糖水平与模型组比较皆降低,有显著性差异(均P<0.01);对照组大鼠血糖与模型组比较无显著性差异(P>0.05);高剂量组大鼠与低剂量组、对照组比较,血糖值皆降低,有统计学差异(均P<0.01);低剂量组与对照组比较血糖降低有显著性差异(P<0.01)。
3.坐骨神经形态学变化
正常组大鼠坐骨神经可见纤维分布排列整齐,轴突髓鞘结构清晰完整,单个纤维饱满,鞘壁均匀,可见到Schwann细胞。与正常组比较,模型组大鼠神经纤维排列松散紊乱,变细,出现裂隙,密度不均匀,有斑块状密度下降,髓鞘空泡变性,Schwann细胞增殖,轴突萎缩甚至消失,毛细血管管壁增厚,管腔不规则。高剂量组大鼠表现为神经纤维较规则,密度增高,有髓神经纤维结构接近正常,可见髓鞘脱落较少,髓鞘中可见正常轴突。低剂量组、对照组大鼠坐骨神经表现为神经纤维肿胀,排列松散,有脱髓鞘现象,轴突萎缩甚至消失。
4.坐骨神经AR、Na+-K+-ATP酶、山梨醇变化
与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经AR活性显著升高(P<0.01);高剂量组与模型组比较AR活性减低(P<0.01),有统计学意义;低剂量组、对照组与模型组大鼠比较AR无明显差异(P>0.05),高剂量组与低剂量组、对照组大鼠比较AR的变化有统计学差异(P<0.01),低剂量组和对照组大鼠比较AR活性无明显差异(P>0.05)。
与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经Na+-K+-ATP酶活性明显减低,有显著统计学意义(P<0.01);高剂量组与模型组大鼠比较Na+-K+-ATP酶活性升高(P<0.01);高剂量组与低剂量组、对照组大鼠比较Na+-K+-ATP酶活性变化有统计学差异(P<0.01),低剂量组和对照组大鼠比较Na+-K+-ATP酶活性无明显差异(P>0.05)。
与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经山梨醇含量明显增加(P<0.01);高剂量组与模型组比较山梨醇含量明显减低(P<0.01),具有统计学意义;高剂量组与低剂量组、对照组大鼠比较山梨醇含量变化有统计学差异(P<0.01),低剂量组和对照组比较山梨醇含量无明显差异(P>0.05)。
5.坐骨神经传导速度、潜伏期的改变
与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经运动神经传导速度明显减慢(P<0.01),潜伏期延长(P<0.01);高剂量组、低剂量组大鼠与模型组比较,神经传导速度有所增快,潜伏期有所缩短,有统计学意义(均P<0.01);对照组大鼠和模型组比较,潜伏期缩短,有显著统计学差异(P<0.01),但神经传导速度无显著变化(P>0.05);高剂量组大鼠与低剂量组、对照组大鼠比较,两项指标变化显著,有统计学意义(均P<0.01)。低剂量组和对照组比较有显著差异(P<0.01)。
结论:
1.温润通络方能够逆转模型大鼠坐骨神经AR、Na+-K+-ATP酶活性、降低山梨醇含量、提高神经传导速度水平。
2.温润通络方改善模型大鼠症状和体征。
3.温润通络方对糖尿病周围神经病变有防治作用。