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蛇毒丝氨酸蛋白酶(Snake Venome Serine Proteinases, SVSPs)是蛇毒中一类重要的具有明显的抗凝、溶栓、促血小板聚集等功能的蛋白水解酶,对凝血-溶栓系统的作用广泛,在临床上有很大的应用价值。虽然其一级结构具有很大的同源性,但是不同的SVSPs却作用于不同的底物,而且一种SVSP往往同时能对多种蛋白底物或者小分子底物具有水解能力,因此成为研究蛋白质结构和功能的极好模型。中介蝮(Gintermedius)蛇隶属于蝰科蝮亚科(Crotalinae),广泛分布于我国西北、华北地区,与广大人们的生活息息相关。因此,对其SVSPs的研究具有重要意义,而分离获得中介蝮的SVSPs是首要条件。本研究的内容和结果：1、中介蝮蛇毒中SVSPs勺分离纯化(1)以中介蝮粗毒为原料,用Sephacryl-200HR凝胶过滤层析自装柱进行初步分离,选择50mmol/L碳酸氢铵(pH8.0,含有0.15mol/LNaCl和0.2g/L的叠氮钠)作为平衡和洗脱缓冲液,分离得到5个蛋白组份(Peak1-5)。以BApNA为底物对获得的峰组份进行活性鉴定,并采用SDS-PAGE电泳对蛋白质纯度进行初步检测。结果表明,Peak2峰组份具有水角BApNA的活性。SDS-PAGE电泳分析显示Peak2非单一条带,说明含有其他种类的杂蛋白,需要进一步分离。(2)用HiTrap DEAE-FF阴离子交换层析柱对Peak2组份进行进一步的分离纯化。上样后以A液(50mmol/L碳酸氢铵,pH8.0)洗脱未结合的组份,之后从A液到100%B液(50mmol/L碳酸氢铵,0.5mol/LNaCl, pH8.0)进行线性梯度洗脱。收集各峰,然后以BApNA为底物对获得的峰组份进行活性鉴定,然后采用SDS-PAGE电泳分析各组份的蛋白纯度。结果表明,Peak2-3、Peak2-4具有水解丝氨酸蛋白酶特定底物BApNA的活性,由于SDS-PAGE、析显示这两个峰组份均不是单一条带,还需进行进一步的分离。(3)用HiTrap CM阳离子交换β β β β层析柱对Peak2-3组份进行最后的分离纯化。上样后以A液(50mmol/L醋酸钠,pH6.0)洗脱未结合的杂质组份,之后从A液到100%B液(50mmol/L醋酸钠,0.5mol/LNaCl, pH6.0)进行线性梯度洗脱。收集各峰,然后以BApNA为底物,对各峰组份进行活性鉴定,并采用SDS-PAGE电泳分析各组份蛋白纯度。结果表明,Peak2-3-1可水解底物BApNA, SDS-PAGE电泳显示Peak2-3-1基本为单一条带,为我们所需要的目的蛋白。2、生物活性表征(1)蛋白纯度鉴定：Peak2-3-1组份分别经还原性和非还原性的SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度,结果显示Peak2-3-1在还原性和非还原性电泳中均为单一条带。(2)分离纯化出的Peak2-3-1经还原性SDS.PAGE后,将含目的蛋白的胶条切下,送公司进行质谱分析。(3)以BApNA为底物,测定Peak2-3-1的酶活力为8.4×10-3nmol/min/mg.(4)特异性抑制剂的作用：以BApNA为底物测定不同的抑制剂：PMSF. EDTA.β-锍基乙醇对Peak2-3-1酶活性的影响,以不加任何抑制剂的Peak2-3-1为对照。结果发现PMSF可显著的抑制Peak2-3-1对BApNA的水解(p<0.05),而EDTA无抑制作用,说明Peak2-3-1是SVSPs,而不是蛇毒金属蛋白酶。(5)纤维蛋白原(Fg)水解活性：Peak2-3-1组份与纤维蛋白原溶液混合均匀,于37℃共同孵育,分不同的时间段取样(0,15,30min,1,2,4,8,12h),然后用12%的SDS-PAGE检测Peak2-3-1又‘维蛋白原0l、13、Y链的水解情况,结果显示,Peak2-3-1能够快速水解纤维蛋白原的BB链,对Act链也有一定的水解作用。(6)类凝血酶活性：Peak2-3-1与纤维蛋白原溶液混合均匀后,37℃孵育,观察白色沉淀的生成。以凝血晦为阳性对照。结果表明,Peak2-3-1不能使纤维蛋白原溶液凝结,不具有类凝血酶活性。(7)纤溶活性：采用纤维蛋白平板法,测定Peak2-3-1的纤溶活性。结果娃示,Peak2-3-1可以水解纤维蛋白,具有纤溶活性。(8)出血活性测定：选用昆明系小鼠,以不同的Peak2-3-1量,对小鼠进行背部皮下注射,24h后处死小鼠,将处死小鼠的背部皮肤剥下,观察出血情况。结果发现,Peak2-3-1量达到50μg时,仍未发现皮下出血斑,说明Peak2-3-1不具有出血活性。(9)小鼠尾巴的流血时间的测定：选用昆明系小鼠,以生理盐水为对照,尾静脉注射Peak2-3-1,注射量为0.5g/kg,观察Peak2-3-1对小鼠尾静脉流血时间的影响。结果表明,与生理盐水对照组(599±165s)相比,Peak2-3-1能明显延长小鼠尾静脉流血时间(984±182s)。结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,从中介蝮蛇粗毒中筛选分离得到了一种蛇毒丝氨酸蛋白酶一Peak2-3-1,其分子量为28.8KDa,是一种蛇毒纤溶酶。Peak2-3-1能够快速的水解纤维蛋白原的Bp链,缓慢水解Aα链。其酶活性可被PMSF显著抑制,而不受EDTA的影响。Peak2-3-1无类凝血酶活性和出血活性,能够显著延长小鼠尾静脉的流血时间。本工作为下一步研究中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶的分子进化及作用机理奠定了基础。