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蛋氨酸作为机体内多种物质的合成前体,可有效调节机体代谢平衡,目前被广泛应用于食品、饲料、医药等行业。微生物发酵法生产氨基酸因具有原料利用率高、操作简便、环境污染小等优点已逐步取代传统化学分离法,但由于蛋氨酸代谢合成途径长、合成过程中多个酶受到复杂的调控抑制作用,至今无法实现微生物发酵工业化生产。本研究以代谢结构清晰的谷氨酸棒杆菌为初始菌株,扩增前期研究获得的高酶活且解除部分反馈抑制的北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense,CP)E31的天冬氨酸激酶(编码基因为lys~m)和高丝氨酸脱氢酶(编码基因为hom~m),并从谷氨酸棒杆菌原菌基因组上扩增高丝氨酸乙酰基转移酶(编码基因为met X)。利用基因工程手段将目的片段与穿梭表达载体PECXK99E进行连接,构建不同过表达基因调控下的氨基酸生产菌。通过荧光定量及液相分析各菌株内部碳流的走向,寻找蛋氨酸代谢阻遏位点。研究发现过表达蛋氨酸合成途径关键酶后苏氨酸产量明显提高,成为阻碍蛋氨酸产量的主要原因,因此对苏氨酸支路起始酶高丝氨酸激酶进行体外改造及酶活弱化,为降低苏氨酸支路碳流的消耗,构建蛋氨酸工程菌提供参考。本研究所得到结论如下:1.通过PCR扩增技术分别获取北京棒杆菌高酶活lys C~m、hom~m基因及谷氨酸棒杆菌met X基因,构建单基因过表达重组载体PEC-lys C~m和PEC-met X,利用同源重组方法对多个目的片段进行连接,获得双基因过表达重组载体PEC-lys C~m-hom~m、PEC-hom~m-met X及三基因过表达重组载体PEC-lys C~m-hom~m-met X。并将重组载体电转入谷氨酸棒杆菌原菌Cg/WT中成功获得5株氨基酸生产菌,分别为Cg/PEC-lys C~m、Cg/PEC-met X、Cg/PEC-lys C~m-hom~m、Cg/PEC-hom~m-met X及Cg/PEC-lys C~m-hom~m-met X。2.对Cg/WT及5株氨基酸生产菌72h发酵产物进行分析,荧光定量结果表明重组载体上各基因在谷氨酸棒杆菌中均得到了成功表达,有效提高了菌株内各基因的转录水平。高效液相结果证明,与Cg/WT相比,Cg/PEC-lys C~m中谷氨酸产量由1.45g/L明显下降至0.52g/L,天冬氨酸家族氨基酸产量都有所增高,过表达基因lys C~m可使得碳流经三羧酸循环后更多的流入天冬氨酸支路,用于下游氨基酸的合成;与Cg/WT相比,Cg/PEC-met X中苏氨酸产量由2.93g/L降至1.24g/L。蛋氨酸产量由1.83g/L增至2.4g/L,谷氨酸及赖氨酸产量无明显变化,过表达met X使得碳流更多的向蛋氨酸流动。3.对比5株氨基酸生产菌液相结果发现:双基因过表达菌株Cg/PEC-lys C~m-hom~m代谢产物中苏氨酸产量明显增高,达到4.2g/L,苏氨酸支路成为谷氨酸棒杆菌中碳流的主要消耗支路。对比Cg/PEC-lys C~m-hom~m和Cg/PEC-lys C~m-hom~m-met X发现,过表达met X可使碳流由苏氨酸支路部分转向蛋氨酸支路进行,使蛋氨酸产量提高到4.14g/L。但苏氨酸产量相比Cg/WT仍有明显增加,苏氨酸支路对碳流的消耗可能是影响蛋氨酸产量的主要原因。因此需要对苏氨酸支路进行改造,减少苏氨酸支路碳流的消耗,从而有利于蛋氨酸产量的增加。4.通过PCR扩增获取谷氨酸棒杆菌thr B基因,并成功构建体外表达载体PET28a-thr B。对重组载体上thr B基因的底物高丝氨酸结合位点A20及ATP结合位点A27和R240分别进行定点突变、随机突变和高通量筛选,获得2株高酶活突变体thr B-A20D和thr B-A20Q,10株低酶活突变体thr B-A20R、thr B-A20L、thr B-A20Y、thr B-A20E、thr B-A20V、thr B-A20H、thr B-D27W、thr B-D27C、thr B-R240L和thr B-R240A。将所有突变体转入大肠杆菌中进行诱导表达培养,经镍柱分离、SDS-PAGE和Western blot验证后获得纯蛋白。对野生型WT-thr B及突变体进行酶动力学测定及酶学性质分析。随后对酶活明显降低的突变体thr B-A20Y进行结构分析,研究表明丙氨酸突变为酪氨酸后,氢供体数增加,同时酪氨酸侧链较大,可能导致高丝氨酸不能很好地进入底物结合口袋,影响酶与底物的结合效率,使酶活显著降低。为谷氨酸棒杆菌蛋氨酸生产的苏氨酸支路弱化提供参考。