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软体动物的贝壳和珍珠是典型的生物矿化产物,探究其形成的分子机制无论对生物矿化的理论研究还是人工育珠的生产实践都具有重要意义。鉴于非编码RNA参与生物代谢调控的普遍性,本文欲验证长链非编码RNA(Lnc MPEG1)和内源性小RNA(pma-mi R-67)在马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)贝壳和珍珠形成过程中的调控作用,以及Lnc MPEG1和pma-mi R-67的互作关系。主要研究结果如下:1.Lnc MPEG1的鉴定和功能分析本研究通过RACE技术获得Lnc MPEG1的全长共2 735bp,生物信息学分析发现Lnc MPEG1由三个外显子编码,最大的ORF只有285 bp,编码94个氨基酸,总的编码概率约为0.0398,没有编码标签,表明Lnc MPEG1没有编码蛋白的潜能。利用q RT-PCR技术检测Lnc MPEG1在马氏珠母贝不同组织的表达分布,发现其在外套膜中央膜区的表达显著高于其他组织(P<0.05),其次为边缘区和珍珠囊。利用ISH检测发现Lnc MPEG1主要定位于外套膜边缘区中褶及套膜区和中央膜区的外侧上皮细胞,并且在细胞核和细胞质中均有定位。此外,Lnc MPEG1在贝壳损伤后12 h的表达发生显著上调(P<0.05),并且从12 h至36 h表达水平保持相对稳定,48 h的表达量最高,说明Lnc MPEG1可能参与贝壳损伤重建过程。利用RNAi进行该基因的敲降,发现贝壳珍珠层和棱柱层的形成发生明显的紊乱。以上结果表明Lnc MPEG1在马氏珠母贝贝壳的形成中发挥重要作用。2.pma-mi R-67的鉴定和功能分析通过高通量测序从马氏珠母贝外套膜和珍珠囊组织测序获得了pma-mi R-67序列(RNA二级结构显示Lnc MPEG1可形成颈环结构编码一个新的mi RNA,其核酸序列与已报道的mi R-67十分相似,故命名为pma-mi R-67),聚类分析表明pma-mi R-67与软体动物帽贝、海蛞蝓和海蠕虫聚为一支,与海蛞蝓mle-mi R-67-3p高度相似(相似度为91%),表明其亲缘关系较近。q RT-PCR检测发现pma-mi R-67在马氏珠母贝中央膜区的表达显著高于其他组织(P<0.05)。利用pma-mi R-67的mimics进行活体过表达,发现pma-mi R-67在实验组套膜区和中央膜区中的表达量均显著上调(P<0.05),且贝壳珍珠层的新生层出现了明显的变化,表明pma-mi R-67参与珍珠层的形成过程。利用mi Randa软件分析,发现pma-mi R-67与9个矿化相关的靶基因具有结合位点,其中包括smad4转录因子和Wnt信号通路的β-catenin。3.pma-mi R-67可由Lnc MPEG1加工产生本论文利用pc DNA3.1~+载体在HEK293T细胞过表达Lnc MPEG1,发现Lnc MPEG1与pma-mi R-67的表达量均显著上调;pc DNA3.1~+-Lnc MPEG1载体与pma-mi R-67互补链p GL3载体共转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告载体系统检测荧光素酶活性变化,发现实验组(pc DNA3.1~+-lnc MPEG1+p GL3-pma-mi R-67-sponge)的双荧光素酶活性显著下调(P<0.05),表明细胞中过表达Lnc MPEG1可生成pma-mi R-67。此外,利用q RT-PCR检测发现活体水平下调Lnc MPEG1后,pma-mi R-67在套膜区和中央膜区的表达也显著下调(P<0.05)。以上结果表明pma-mi R-67可由Lnc MPEG1加工生成。4.Pm Ago2基因克隆与表达分析Ago2是Lnc RNA和mi RNA调控途径的重要分子。本论文利用RACE技术克隆获得马氏珠母贝Ago2(Pm Ago2)基因c DNA全长共3 465 bp,开放阅读框2 679 bp,编码892个氨基酸残基,5’UTR为113 bp,3’UTR为673 bp;预测其分子量为101.1k D,理论等电点为9.48;多序列比对的结果表明,Pm Ago2与脊椎动物和其他无脊椎的Ago2具有较高的保守性,与美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的相似度高达88%;q RT-PCR结果显示,Pm Ago2在马氏珠母贝各个组织均有表达,其中外套膜边缘区的表达量最高。利用脊椎动物Ago2抗体,通过Western blotting检测其在外套膜组织中的表达,发现Ago2蛋白的分子量在100 k D左右,与理论的分子量相一致。