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新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）是一种高传染性和致死性的病毒,其刺突蛋白（Spike）在新型冠状病毒疫苗的开发中常作为关键抗原,能够引发人体产生高效的体液免疫及细胞免疫。单独以S蛋白上的受体结合域（Receptor binding domain,RBD）作为免疫原也是目前常用的疫苗研发策略之一。腺相关病毒（Adeno-Associated Virus,AAV）作为一种复制缺陷型病毒,其低免疫原性、多种组织趋向性、非致病性以及对外源基因表达的稳定性等特点,为成为基因治疗的优良递送载体创造了条件。AAV在抗病毒疫苗领域的研究表明AAV诱导的免疫反应表现出比其他类型疫苗（包括重组蛋白、灭活病毒）更高效持久的效果。本课题中使用的AAV2.5Tcap是在定向进化条件下由AAV2（aa1-128）和AAV5（aa129-725）进行重组获得,其中第581位氨基酸由A突变成T。这种重组型衣壳包装的AAV对呼吸道上皮细胞表现出了更强的结合力,并且已经证实能够成功介导囊性纤维化跨膜传导,纠正人类囊性纤维化（CF）的氯离子运输缺陷。这一重组病毒载体具有成为呼吸道相关疾病基因治疗以及病毒疫苗载体的潜力。基于AAV在基因治疗和抗病毒疫苗领域广阔的应用前景,AAV产量需求激增,获得一种低成本且高产的AAV生产体系成为关键。目前存在的rAAV生产方式中,昆虫/杆状病毒表达系统是其中较为高效的生产方式之一。我们利用家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,Bm NPV）表达系统,以家蚕生物反应器为平台生产一种嗜呼吸道的重组腺相关病毒rAAV2.5T-RBD,以探索利用rAAV生产针对新冠病毒的高特异性病毒载体疫苗的可行性。本实验中,我们首先构建并验证了重组质粒pAAV-R2.5C和pAAV-RBD,同商品化的p Helper质粒共同在哺乳动物细胞系AAV293中进行三质粒转染,并验证目的蛋白的表达。将蛋白表达盒克隆入杆状病毒表达系统的穿梭载体,构建pFastBacAAV2ITR/RBD、pFastBacAAV2.5TCap,进而筛选重组杆粒并转染家蚕Bm N细胞系获得r Bm NPV-AAV2ITR/RBD和r Bm NPV-AAV2.5TCap。通过检测重组杆状病毒共感染后标记蛋白EGFP、病毒载体蛋白Rep及Cap确定各蛋白均可以稳定表达至P4代,且在P3代达到峰值。以直接注射的方式将两种P3代的重组杆状病毒共感染5龄起蚕的家蚕幼虫,感染后72h可观察到重组病毒中的绿色荧光蛋白在幼虫体内高效表达,检测已发病幼虫的组织和器官发现血淋巴和脂肪体中蛋白表达量高。同时,利用P3代重组病毒注射感染家蚕蚕蛹,48h后即可检测到各蛋白的高效表达,证明目的蛋白在蚕蛹中的表达要早于家蚕幼虫。重组型AAV载体的纯化方法对载体的产量和质量有很大的影响。我们通过预实验对比氯化铯（CsCl）超速离心与碘克沙醇（iodixanol）密度梯度超速离心后,选择用后者进行rAAV2.5T-RBD的纯化,碘克沙醇密度梯度离心法不仅在用时上大大节省时间,分离效果也明显优于氯化铯法。经纯化后的病毒样品利用透射电子显微镜（TEM）可观察到20-25nm左右的病毒粒子,但Bm N细胞中所纯化得到的病毒粒子多为未成功包装的AAV2.5T衣壳,q PCR检测可知Bm N细胞中的完整病毒粒子量远低于家蚕和蚕蛹的纯化样品。而家蚕和蚕蛹纯化样品中虽能得到较为完整的病毒粒子,但在TEM结果中显示样品中含有较多直径为10nm左右的杂质未能成功去除,表明这一生产系统在未来仍需要对包装效率和纯化方法进行进一步优化。由于新冠疫情影响,无法获得敏感细胞系人呼吸道上皮细胞HAE-ALI。因此在转导效率的测定中我们尝试利用纯化的rAAV2.5T-RBD感染人支气管上皮细胞（16HBE）,在感染后7天左右可以观察到少量的荧光表达,这一结果证实纯化的病毒粒子应具备一定转导活性,由于16HBE细胞不是rAAV2.5T-RBD的敏感细胞系,导致感染及转导效率较低。之后我们将在获得HAE-ALI细胞后尝试利用流式细胞荧光分选技术更为准确地检测其转导活性。在本课题中我们构建了一个利用家蚕杆状病毒表达系统生产rAAV2.5T-RBD载体的rAAV生产系统,并通过比较获得了更高效的rAAV纯化方法。新生产系统可以成功生产出重组病毒rAAV2.5T-RBD。这项工作表明家蚕生物反应器应用于重组AAV载体规模化生产中的巨大潜力,为病毒载体疫苗的商业化生产提供了参考。