论文部分内容阅读
从基因水平来研究丝状真菌与重金属间的相互作用具有重要的意义,近年来发展的根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)与传统的遗传转化方法相比较,ATMT具有高效、稳定、高频单拷贝随机插入、适用范围广等优点,是目前研究丝状真菌遗传转化的主要手段之一。
基于本实验室工作曾分离得到一株高抗多种重金属盐并对苯菌灵敏感的微紫青霉菌(Penicllium janthinellum)菌株GXCR的良好基础,研究将建立由根癌农杆菌LBA4404介导的GXCR菌株的遗传转化体系,为从基因水平上研究该菌株对重金属盐抗性的可能机制提供基础。
本研究在质粒pGSA1252基础上构建了T-DNA区含有苯菌灵抗性基因(Benomyl resistance)的双元载体pG-Bn,通过三亲转化法导入到根癌农杆菌LBA4404中,与稀释至107个/ml的GXCR孢子共培养两天后筛选得到具有苯菌灵抗性的转化株367株,对随机挑取的40株转化株总DNA进行PCR验证,有98%的转化株均能扩增出目的片段,转化效率达到了3.7个转化株/10个小菌块。随机挑选30个能扩增出目的片段的转化株中,有13个转化株不能在CuSO4 PDA平板上生长,9个转化株的生长明显受CuSO4抑制。同时对表型明显发生变化的转化株总DNA进行Southern杂交分析,结果显示, 62.5%的转化株为T-DNA单拷贝整合插入,易于利用插入突变来分析相关基因的功能,为对微紫青霉菌菌株GXCR的抗重金属遗传机制的研究提供了宝贵的材料。