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人们生活水平的提高以及一些不良生活和/或饮食方式的长期存在,导致肥胖症、糖耐量减低、胰岛素抵抗和2型糖尿病患病人群数量不断上升,这已经成为一个公共卫生问题,引起内分泌、心脑血管疾病等临床医生以及公共卫生研究学者的高度重视。临床研究和流行病学调查已经证实,这些代谢性疾病与心血管疾病的发生关系密切,代谢综合症和2型糖尿病已经被认为是冠心病的等危症。肥胖所导致的炎症因子分泌的增加是导致胰岛素抵抗的重要因素,也是导致内皮细胞损害和功能紊乱的原因之一。2型糖尿病患者过高的血糖状态同样对血管内皮尤其是微循环血管内皮会造成损害,这对增加动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的发生和促进病变的进一步发展非常重要。脂联素是脂肪组织分泌的特异性的脂肪细胞因子,与肥胖、糖耐量异常、胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关,患有这些疾病的人群血浆脂联素水平显著下降。最近研究表明,脂联素通过抑制泡沫细胞的形成、抑制细胞凋亡、减少炎症因子的产生和聚集从而发挥抗动脉粥样硬化病变的作用。血管内皮细胞的功能状态与各种心血管疾病的发生发展关系密切。在内皮损伤或高血糖等因素刺激下,血管内皮功能会发生紊乱。与正常人群相比,患有高血压、冠心病等心血管疾病的人群血浆脂联素水平显著降低。目前,低脂联素血症被认为是冠心病独立的危险因素和预测因子,同时与冠心病病变严重程度密切相关,因此也被作为预后预测的指标之一。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞,不仅参与胚胎时期血管的形成,也参与出生后血管的新生和内皮损伤的修复,这对于预防和治疗各类与血管损伤有关的心血管疾病有着重要的病理和生理学意义。有关EPCs在各种缺血性疾病和创伤治疗中的应用以及如何有效促进机体EPCs的增殖分化是目前该领域的研究热点。已有研究发现在小鼠造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)表面存在脂联素受体,脂联素可促进HSCs在体内外的增殖并提高其功能,被认为是其不可缺少的生长因子。EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,同时具有内皮细胞和祖细胞的一些生物学特性。EPCs是否也表达脂联素受体,脂联素对EPCs的增殖和分化功能有无影响目前尚不清楚。基于上述的理论基础,我们提出假设:脂联素可能影响EPCs的数量和功能,从而影响血管内皮损伤的修复能力,维持内皮损伤和修复之间的动态平衡,促进内皮功能的恢复,进而延缓动脉粥样硬化病变的发生和发展。因此,本实验的目的是了解EPCs中是否存在脂联素受体的表达,以及脂联素是否影响EPCs的增殖和分化,同时探讨其可能的作用机制。以下分2部分对本研究的方法、结果和结论等作一简述。第一部分内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及脂联素受体的表达目的:对脐血EPCs进行分离、培养和鉴定;探讨EPCs是否存在脂联素受体的表达。方法:采用Ficoll密度梯度离心法从人脐静脉血中获得单个核细胞,接种于预包被有人纤维连接蛋白的培养板中,经贴壁筛选法纯化,用FITC-UEA-I和DiI-Ac-LDL双染色法和流式细胞技术检测EPCs表面标志(CD34、VEGFR-2和AC133)来验证分离、培养所得EPCs;并通过RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学等方法检验EPCs中是否存在脂联素受体的表达。结果:培养所得的细胞81.4±11.7%为FITC-UEA-I和DiI-Ac-LDL染色呈双阳性;用流式细胞技术检测其表达VEGFR-2(76.6±7.0%)、CD34(42.9±8.5%)、AC133(19.8±3.9%);脂联素受体AdipoR1和AdipoR2的mRNA和蛋白EPCs上均有表达。结论:1.采用密度梯度离心后贴壁筛选培养的方法可以从人脐静脉血中成功分离培养EPCs。2.分离培养的EPCs中存在脂联素受体AdipoR1和AdipoR2的表达。第二部分脂联素对内皮祖细胞增殖分化的影响及其机制探讨目的:观察脂联素对分离培养的EPCs增殖分化的影响并初步探讨其可能的作用机制。方法:分离的EPCs培养15-20天后,用MTT法观察脂联素对EPCs增殖的影响。用Real time PCR检测vWF、CD31、CD34、AC133相对表达量评价脂联素对EPCs分化的影响。用Western blot检测脂联素作用后不同时间p-JNK、JNK、p-p38、p38、ERK、p-ERK等蛋白的表达,并用信号转导抑制剂SB203580和SP600125干预加以验证脂联素对EPCs增殖分化影响的可能信号传导途径。结果:脂联素作用后能使EPCs数量(及其MTT值)增加,30μg/ml和作用48h时最明显;脂联素(30μg/ml)干预48h后细胞表达vWF、CD31mRNA的相对量有所增加,而CD34、AC133 mRNA的表达水平则有下降;脂联素干预后5min,可检测到EPCs中p38和JNK磷酸化,30min达高峰,60min稍有下降,而ERK无磷酸化(p-ERK)表达。p38信号传导抑制剂SB203580和JNK信号传导抑制剂SP600125则可阻断脂联素的促进p38和JNK磷酸化作用;SB203580可减弱脂联素的促增殖效应;而SP600125可减弱其对EPCs的促分化作用。结论:1.脂联素可促进EPCs的增殖和分化,该作用有一定的时间和剂量依赖性。2.MAPK途径参与脂联素对人EPCs增殖和分化的促进作用。