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研究目的克罗恩病(CD)是一种慢性复发性炎症性肠病,其发病机制不明。本研究目的是确定O-连接的糖基化修饰(O-Glc NAc)在CD发病中的作用及其分子机制,评估O-Glc NAc抑制剂对CD的潜在治疗作用。研究方法1.免疫组织化学染色检测O-Glc NAc、OGT、OGA在人正常肠组织、非活动期CD患者及活动期CD患者肠组织中的表达。2.免疫印迹技术检测AIEC LF82感染的结肠癌细胞中O-Glc NAc、OGT、OGA的蛋白表达。3.选取AIEC LF82灌胃法处理C57BL/6小鼠,免疫组织化学染色检测小鼠回肠组织中O-Glc NAc的表达。4.用UDP-Glc NAc标准品校准后,通过UV检测对细胞内UDP-Glc NAc进行定量。5.琥珀酰化小麦胚芽凝集素(s WGA)沉淀检测IKK/IκB/NF-κB的O-Glc NAc。6.通过细胞免疫荧光及免疫印迹检测NF-κB p65亚基的定位,荧光素酶报告实验检测p65亚基的激活。通过酶联免疫吸附实验检测NF-κB信号下游炎性细胞因子的表达。7.将用于监视自噬的载体GFP-LC3转染到人结肠癌细胞系,细胞免疫荧光检测AIEC LF82感染样本中自噬体的形成;免疫印迹检测自噬相关基因LC3、p62、ATG16的蛋白表达。8.通过菌落形成单位(CFU)计数法检测调控O-Glc NAc的表达能否影响细菌菌落的清除。9.通过AIEC LF82和DSS共处理的方法构建小鼠结肠炎模型,监测O-糖基化抑制剂DON处理对小鼠体重、典型结肠炎症状及生存期限的改善情况。研究结果1.与人正常肠组织相比,活动期CD肠组织O-Glc NAc表达显著升高,非活动期CD肠组织O-Glc NAc也轻度增高。2.正常肠组织、非活动期CD肠组织及CD肠组织中,OGT和OGA的表达仅略微改变。3.感染AIEC LF82的小鼠肠上皮组织中O-Glc NAC表达升高,而OGT和OGA的改变并不显著。4.AIEC LF82感染上调人结肠癌上皮细胞HCT116及HT-29中糖基化供体葡萄糖胺(UDP-Glc NAc)水平,并增加O-Glc NAc。细菌UDP-Glc NAc抑制剂2-苯基苯并呋喃(2-phenylbenzofuran)显著降低宿主细胞中UDP-Glc NAc水平及O-Glc NAc修饰。5.在AIEC LF82感染细胞中,IKKβ和NF-κB O-Glc NAc糖基化明显升高。IKKβ(S733A)和p65(T352A)的突变抑制IKKβ和NF-κB的O-Glc NAc糖基化,并抑制AIEC LF82感染导致的NF-κB激活。6.一种阻断UDP-Glc NAc产生并抑制O-Glc NAc的药物,6-二氮杂-5-氧代-L-正亮氨酸(DON),能够使AIEC LF82感染的HCT116细胞中NF-κB失活,减少促炎细胞因子IL-1和IL-6的释放。7.AIEC LF82感染抑制宿主细胞自噬形成,O-Glc NAc抑制剂DON增强细胞自噬,促进AIEC LF82清除。8.DSS和AIEC LF82共处理诱导小鼠发生典型的结肠炎症状,如体重减轻、腹泻、血便及生存期限的缩短。9.DON明显减轻DSS和AIEC LF82诱导的结肠炎小鼠肠上皮炎症反应,提高感染小鼠的存活率。研究结论1.CD患者和AIEC LF82感染小鼠的肠上皮组织中O-Glc NAc表达增加。2.感染AIEC LF82上调结肠癌上皮细胞HCT116及HT-29中UDP-Glc NAc的水平,并增加O-Glc NAc。3.AIEC LF82感染致宿主细胞IKKβ和NF-κB的O-Glc NAc糖基化明显升高。糖基化抑制剂DON降低AIEC LF82感染细胞中NF-κB的激活,增强自噬,促进宿主细胞内AIEC LF82的清除。DON处理显著缓解DSS和AIEC LF82诱导的小鼠结肠炎炎症,提高感染小鼠存活率。