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兔出血症病毒（RHDV,Rabbit Hemorrhagic Disease Virus）属于杯状病毒科,能够引起兔病毒性出血症（RHD,Rabbit Hemorrhagic Disease）。VP60蛋白是RHDV的主要结构蛋白,在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关。由于尚未建立兔出血症病毒在体外组织细胞的培养方法,目前广泛使用的RHD疫苗仍为组织灭活疫苗,虽然临床上其具有良好的免疫效果,但组织灭活苗自身具有不可避免的一些缺陷。因此,本研究首先对RHDV中国流行株进行了遗传变异分析,接着通过构建重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达VP60基因并制备成疫苗,并研究其抗原性和免疫原性,为研究RHDV杆状病毒载体灭活疫苗奠定了基础。主要研究内容如下:1.2009～2014年我国兔出血症病毒遗传变异分析为了调查中国兔出血症病毒毒株的遗传变异和进化,我们对GenBank数据库上包括41株中国毒株在内的190株国内外兔出血症病毒VP60序列进行了分析,主要内容包括:（1）对所有中国RHDV毒株的基因型进行了分析,发现41株中国毒株中WX/China/1984株、HB/2014株和HB株属于RHDV G2基因型,其余38株均属于G6（RHDVa）基因型。（2）对2009年至2014年期间中国六省分离到的8株新的兔出血症病毒VP60序列进行了分析,并与疫苗株WF/China/2007进行了比较。我们对分离到的中国RHDV新毒株进行了综合分析,包括血凝试验、western blottling、衣壳蛋白抗原性鉴定以及系统发育分析,并鉴定出一株新的抗原变异株。其中,从中国北方分离到的毒株HB/2014经鉴定为一株无血凝毒株,且属于经典型RHDV（G1-G5）基因型,而另外7株RHDV分离株都属于在2014年之前在中国广泛分布并流行的RHDV G6（RHDVa）基因型。对VP60基因的抗原性分析表明新分离株HB/2014与其它中国毒株在核苷酸序列上差异很大,但是目前使用的疫苗仍然能够对毒株HB/2014的攻毒提供完全的免疫保护。（3）为了对中国RHDV的分子进化有更深入的了解,我们对中国RHDV衣壳蛋白VP60基因进行了重组分析,结果发现一株重组毒株NanBu/China/2011株。该重组株VP60核苷酸序列的393和1079位点为发生G2型和G6型重组的位点。NanBu/China/2011株394-1078核苷酸序列属于G2基因型,而去除394-1078核苷酸序列的整个VP60序列属于G6基因型。总之,以上结果对中国RHDV分子进化的更深入了解提供了新的流行病学资料,但该病毒在中国兔群间的流行需要进一步研究。2.表达兔出血症病毒VP60基因的重组杆状病毒的构建、鉴定及稳定性研究用RT-PCR方法从中国皖阜株WF/China/2007（FJ794180）攻毒死亡兔的肝脏中扩增兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因,经序列测定,大小为1740 bp。通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid-VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组兔出血症病毒 VP60 杆状病毒（BAC-VP60 株）,经 RT-PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定及电镜观察。结果显示,重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达,且可形成直径约为40nm的病毒样颗粒。将本实验室保存的Sf9细胞培养成生长良好的单层,连续传代培养至60代,每代细胞生长为致密单层时间为48～54小时,细胞上清pH值为6.2左右,与原始培养基相比,pH值基本无变化,显微镜检查各代细胞形态基本一致。经检测,Sf9细胞无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染,无致瘤性。利用P8代湿毒分别接种第5、10、60代Sf9昆虫细胞,测得接毒细胞培养物TCID50及HA效价基本不变。3.兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗的制备及免疫保护效力研究为研究RHDV杆状病毒载体灭活疫苗的免疫保护作用,将制备的兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗接种两月龄易感兔,从体液免疫应答和细胞免疫应答两个方面评估疫苗的免疫效力,同时与RHD灭活苗进行免疫效果比较。结果显示,在免疫7日后开始,在RHDV杆状病毒载体灭活疫苗组和RHD灭活疫苗组血清中即可检测到特异性抗体IgG的显著升高,与PBS组相比差异显著（P<0.05）;细胞因子的ELISA检测结果显示,与PBS对照组相比,在免疫3日后,RHDV杆状病毒载体灭活疫苗组即可检测到血清中IL-2、IL-4和IFN-γ含量的显著增高（P<0.05）,RHD灭活疫苗组IL-4和IFN-γ含量显著（P<0.05）升高,但血清IL-2含量差异不显著（P>0.05）;攻毒保护试验结果显示,RHDV杆状病毒载体灭活疫苗组和RHD灭活疫苗组所有家兔均为死亡,没有出现临床症状,剖检后无典型的病理变化,而PBS组所有家兔在攻毒后3天内全部死亡,具有典型的RHD死亡症状和病理变化。经测定,所制备的RHDV杆状病毒载体灭活疫苗的最小免疫剂量为0.25 mL/只（含灭活前抗原HA效价为1:64）。家兔在免疫RHDV杆状病毒载体灭活疫苗（1mL/只）后7日即可产生坚强的免疫力,可以对RHDV强毒提供完全保护。免疫保护试验显示RHDV杆状病毒载体灭活疫苗还可以对当前中国多个省市采集到的不同基因型流行株的攻击提供完全保护。以上研究结果表明,RHDV杆状病毒载体灭活疫苗能诱导家兔产生较强的体液免疫和细胞免疫应答应答,为免疫兔提供完全保护。