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一、目的:大肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,死亡率位居恶性肿瘤第三位。大肠癌的发生与原癌基因激活,抑癌基因及DNA修复基因的突变等诸多因素相关。目前大肠癌的治疗包括手术、放疗、化疗、靶向治疗、生物免疫治疗、中药治疗等。晚期大肠癌一线化疗有效率为30%-40%,若加用靶向治疗有效率可达50%-60%。因此,寻找新的治疗靶点和药物对大肠癌的综合治疗具有积极意义。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）逆转录催化端粒酶,将端粒重复序列（5’到3’方向TTAGGG/CCCTAA）合成到染色体末端,延长或稳定了随细胞分裂而进行性缩短的端粒,在恶性肿瘤的发生发展中起到了重要作用。hTERT在大肠癌、肝癌、胃癌、肺癌中均高表达,并对肿瘤的预后有重要意义。研究显示,hTERT的转录调控正在成为肿瘤研究的热点方向。hTERT的转录调控可显著影响肿瘤细胞的生长,及多能干细胞的分化。本文通过生物素链霉亲和素垂钓系统寻找hTERT新的转录调控子,并用质谱分析和蛋白组学鉴定,首次发现Keratin23（KRT23）可能为hTERT的转录调控蛋白。KRT23属于酸性角蛋白的一种。已有研究表明酸性角蛋白与肿瘤的侵袭及迁移相关,某些角蛋白已成为肿瘤诊断和预后的标志物。然而,KRT23在肿瘤生长中的分子机制以及KRT23和hTERT之间的调控机制尚不清楚。中医药治疗作为肿瘤综合治疗的一部分,占有重要的地位。华蟾素在中国已经被批准用于癌症的治疗。Bufalin（蟾毒灵）作为华蟾素中的主要有效单体,在大肠癌、肝癌、膀胱癌等肿瘤中发挥显著的抗肿瘤作用。然而,Bufalin在大肠癌中的抗肿瘤机制尚不清楚全面,对本文的中心研究因子hTERT是否存在调控关系及调控机制也未可知。因此,本实验通过KRT23及Bufalin对hTERT的调控研究,探讨KRT23、Bufalin及hTERT在大肠癌生长中的分子机制,以期为大肠癌的临床治疗提供科学依据。二、方法（一）KRT23调控hTERT的表达并参与大肠癌生长机制研究1、利用生物素标记的hTERT启动子区的双链寡核苷酸探针,通过启动子结合蛋白垂钓系统,垂钓结合在hTERT启动子区的蛋白,经过银染、质谱分析、蛋白组学鉴定发现这一蛋白可能为KRT23。通过下拉实验（pull-down）及核染色质免疫共沉淀（CHIP）反证KRT23是否为hTERT启动子区结合蛋白;2、收集2003年—2008年中国医科大学肿瘤医院暨辽宁省肿瘤医院154例随访资料完整的结直肠癌术后患者石蜡标本,病理诊断明确,末次随访时间为2016.3.1。采用免疫组化法检测KRT23和hTERT的表达,分析两者之间的相关性,及其与大肠癌患者生存预后之间的关系。应用SPSS 21.0统计软件,Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,Cox回归进行多因素生存分析,P＜0.05具有统计学意义。收集2015年大连医科大学附属第一医院7例结直肠癌术后患者肿瘤及癌旁组织,采用Western blot检测癌组织及癌旁组织中KRT23和hTERT的蛋白表达水平。采用激光共聚焦（confocal）及Western blot,检测KRT23和hTERT的亚细胞定位及表达;3、采用脂质体瞬时转染技术,将KRT23 si RNA转染至结肠癌Lo Vo细胞株（KRT23高表达）,下调KRT23的表达。采用病毒感染技术,将KRT23的慢病毒感染至结肠癌RKO细胞株（KRT23低表达）,上调KRT23的表达;4、Lo Vo细胞中敲低KRT23后,采用RT-PCR,检测KRT23和hTERT在m RNA水平的表达;采用Western blot,检测KRT23和hTERT在蛋白水平的表达;采用荧光素酶报告基因（Luciferase）,检测hTERT启动子区的Luciferase活性;采用MTT及克隆形成实验,检测细胞活力和增殖能力;采用划痕实验,检测迁移能力;采用Western blot,检测hTERT下游MAPK信号通路的p-p38、p38、p-ERK、ERK在蛋白水平的表达;采用成球实验,检测细胞的成球数目和大小;采用Western blot,检测CD44、CD133在蛋白水平的表达,以分析KRT23、hTERT表达对肿瘤增殖、迁移恶性生物学行为及肿瘤干性特征的影响;5、RKO细胞中过表达KRT23后,采用RT-PCR,检测KRT23和hTERT在m RNA水平的表达;采用Western blot,检测KRT23和hTERT在蛋白水平的表达;采用荧光素酶报告基因（Luciferase）,检测hTERT启动子区的Luciferase活性;采用MTT及克隆形成实验,检测细胞活力和增殖能力;采用划痕实验,检测迁移能力;采用Western blot,检测hTERT下游MAPK信号通路的p-p38、p38、p-ERK、ERK在蛋白水平的表达;采用成球实验,检测细胞的成球数目和大小;采用Western blot,检测CD44、CD133在蛋白水平的表达,以分析KRT23、hTERT表达对肿瘤增殖、迁移恶性生物学行为及肿瘤干性特征的影响;6、建立BALB/c-nu裸鼠结肠癌模型,KRT23 si RNA进行干预,体内实验验证敲低KRT23对hTERT表达及肿瘤负荷的影响。（二）Bufalin通过CPSF4调控hTERT表达干预大肠癌生长的研究1、采用CCK8实验、克隆形成实验、细胞周期流式实验、Western blot实验检测梯度浓度的Bufalin对结肠癌SW620细胞株细胞活力、集落形成、细胞周期、细胞周期蛋白cyclin B1、p-cdc2、p21的影响;2、采用CCK8实验、克隆形成实验、细胞周期流式实验、Western blot实验检测梯度浓度的Bufalin对结肠癌Lo Vo细胞株细胞活力、集落形成、细胞周期、细胞周期蛋白cyclin B1、p-cdc2、p21的影响;3、采用细胞凋亡流式实验、AO/EB实验、Western blot实验检测梯度浓度的Bufalin对结肠癌细胞系SW620、Lo Vo的细胞凋亡,凋亡特异性形态改变及凋亡蛋白PARP、Bax、Bcl-2、cleaved caspase7、cleaved caspase9的影响;4、采用划痕实验、Western blot实验检测梯度浓度的Bufalin对结肠癌细胞系SW620、Lo Vo的迁移及蛋白N-cadherin、E-cadherin、β-catenin的影响;5、采用pull-down及CHIP实验,检测梯度浓度的Bufalin处理下,结肠癌细胞系Lo Vo和SW620中垂钓的hTERT启动子区的结合蛋白,提示CPSF4为变化最为显著的转录调控子。采用脂质体瞬时转染技术将CPSF4过表达质粒转染至Lo Vo细胞中,上调CPSF4的表达。采用Western blot实验和luciferase实验检测梯度浓度的Bufalin对CPSF4、hTERT蛋白及hTERT启动子区luciferase活性的影响。三、结果（一）KRT23调控hTERT的表达并参与大肠癌生长机制研究1、KRT23为hTERT的启动子区结合蛋白;2、KRT23和hTERT在结肠癌组织和细胞中高表达并影响大肠癌患者的预后;3、KRT23调控hTERT m RNA水平和蛋白水平表达及启动子区luciferase活性;4、敲低KRT23可能通过下调hTERT表达,抑制结肠癌LoVo细胞的增殖、迁移、干性及CD133、CD44的表达;5、过表达KRT23可能通过上调hTERT表达,促进结肠癌RKO细胞的增殖、迁移、干性及CD133、CD44的表达;6、敲低KRT23在裸鼠中抑制结肠癌异种移植肿瘤的生长。（二）Bufalin通过CPSF4调控hTERT表达干预大肠癌生长的研究1、Bufalin抑制SW620细胞的细胞活力和集落形成并将SW620细胞周期阻滞在G2/M期;2、Bufalin抑制Lo Vo细胞的细胞活力和集落形成并将Lo Vo细胞周期阻滞在G2/M期;3、Bufalin使SW620、Lo Vo细胞发生了形态学改变并诱导SW620、Lo Vo细胞的凋亡;4、Bufalin抑制Lo Vo、SW620细胞的迁移;5、Bufalin通过CPSF4抑制hTERT的表达。四、结论（一）KRT23调控hTERT的表达并参与大肠癌生长机制研究1、KRT23为hTERT启动子区结合蛋白,可能通过调控hTERT表达促进大肠癌恶性生物学行为及干性特征;2、KRT23、hTERT为大肠癌预后不良因素。（二）Bufalin通过CPSF4调控hTERT表达干预大肠癌生长的研究1、Bufalin抑制结肠癌细胞的增殖和迁移,诱导结肠癌细胞的凋亡;2、Bufalin通过CPSF4抑制hTERT的表达。