论文部分内容阅读
目的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是导致慢性肝病和肝相关疾病发生率及死亡率的常见病因,现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因,患病率已超过15%。对于NAFLD的治疗,至今仍然没有特异性的靶向药物,因此,寻找新的靶点是当务之急。通过文献学习以及课题组前期工作积累,我们意识到脂肪组织来源的循环miRNA可能通过介导肝脏组织中MST1基因的表达,调节肝脏脂质代谢进而影响NAFLD的发生发展。对于这一假设的探讨和验证,将为肝脏与脂肪组织的代谢联系提供新的实验证据,并为NAFLD的治疗与诊断提供新的方案和手段。方法1.参考文献“Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues”中的Supplementary Table 1-人脂肪组织来源循环miRNA数据库,得到人脂肪组织循环miRNA数据信息;随后利用TargetScan、miRDB数据库筛选得到可能靶向人MST1 3’UTR的miRNAs;最后通过维恩图取交集得到九个miRNAs,即筛选到可能靶向人MST1 3’UTR区的脂肪来源的miRNAs。通过Western blotting及双荧光素酶报告实验筛选出具有明显的靶向MST1作用的microRNA。2.设计并合成hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p引物,以人基因组DNA为模板,利用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真酶扩增目的基因hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p全长。使用限制性内切酶BamH I和Sal I将CD810A-1-EGFP载体和目的片段hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p基因分别双酶切,核酸电泳后使用胶回收试剂盒回收纯化目的条带,使用DNA Ligation Kit Ver.2.1快速连接酶在16℃水浴条件下30min,快速连接线性化的载体与目的片段。将连接产物转化至Stbl3感受态细胞,在LB固体培养基上过夜培养12 h-16 h,挑选合适的单克隆溶于微量无菌ddH2O,对其进行快速PCR鉴定。初步鉴定成功的单克隆在LB液体培养基中过夜振荡培养12 h-16 h,使用质粒小提试剂盒提取质粒,并将重组质粒进行双酶切鉴定,鉴定结果正确的菌落克隆用于测序,测序正确的克隆即为构建成功的CD810A-1-EGFP-miR448和CD810A-1-EGFP-miR518a-3p重组质粒,进行无类毒素中提备用。3.HepG2细胞铺于6孔板,每孔约1.2×106个细胞,培养12 h后,分别用0μM,125μM,250μM棕榈酸（palmitic acid,PA）孵育HepG2细胞12 h或24 h,选择最适孵育浓度及时间建立体外非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型,通过油红O染色、细胞内甘油三酯（TG）含量测定以及Western blotting实验检测MST1表达水平判断造模情况。将重组质粒CD810A-1-EGFP-miR448、CD810A-1-EGFP-miR518a-3p及对照组转染到HepG2细胞中,转染48 h后采用PA诱导24 h。油红O染色检测细胞内脂滴堆积情况,采用甘油三酯检测试剂盒测定细胞内甘油三酯的含量,通过Western blotting检测细胞内pMST1/MST1蛋白及其下游脂代谢相关蛋白pSREBP/SREBP、pAMPK/AMPK的表达水平。4.从临床收取NAFLD病人组及NAFLD对照组的血液样本、肝脏组织以及脂肪组织。通过B超检查、血生化检查及肝脏组织切片HE染色判断肝脏细胞内脂滴堆积情况,其中NAFLD疾病组入组13例,NAFLD阴性对照组入组11例。qPCR检测血液样本、肝脏组织及脂肪组织中MST1基因的表达水平以及hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p的表达差异。结果1.成功筛选到靶向肝脏MST1基因的hsa-miRNA从文献“Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues”的Supplementary Table 4-可得到脂肪代谢障碍病人体内下调的hsa-miRNA共231个;通过TargetScan、miRbase等数据库预测可能靶向人MST1-3’UTR区的hsa-miRNA共15个,取二者之交集,筛选出可能靶向人MST1-3’UTR区的脂肪来源的hsa-miRNA共计9个。通过Western blotting实验检测各组细胞中MST1的蛋白表达,在候选的9个hsa-miRNA中,miR-448和miR-518a-3p的蛋白表达水平明显下降。双荧光素酶报告基因实验检测人MST1 3’UTR区的荧光素酶活性的表达,亦发现miR-448和miR-518a-3p可使人MST1 3’UTR区的荧光素酶活性明显减弱。2.成功构建hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p过表达载体首先我们对新购买的CD810A-1质粒进行改造,添加EGFP绿色荧光标记,以便于后期对转染效率的评估及对表达载体的追踪。将构建好的重组质粒CD810A-1-EGFP转入感受态细胞Stbl3中进行扩增,通过对菌水的PCR鉴定和对重组质粒的双酶切鉴定,以及重组载体CD810A-1-EGFP转染293T细胞的荧光采集,表明CD810A-1-EGFP重组载体改造成功。将构建好的重组质粒CD810A-1-EGFP-miR448、CD810A-1-EGFP-miR518a-3p转入感受态细胞Stbl3中进行扩增,通过对菌水的PCR鉴定和对重组质粒的双酶切鉴定,以及重组载体CD810A-1-EGFP-miR448、CD810A-1-EGFP-miR518a-3p转染293T细胞的荧光采集,表明CD810A-1-EGFP重组载体改造成功。3.PA诱导HepG2细胞构建NAFLD细胞模型HepG2细胞铺于6孔板,每孔约1.2×106个细胞,培养12 h后,分别用0μM,125μM,250μM PA孵育HepG2细胞12 h和24 h,通过油红O染色发现,250μM PA诱导24 h组细胞内脂滴含量明显高于其他组。通过甘油三酯测定试剂盒检测细胞内甘油三酯的含量,并利用BCA法获得的总蛋白浓度对细胞内甘油三酯含量进行校正,观察到250μM PA诱导24 h组细胞内甘油三酯含量明显高于其他组,细胞内MST1蛋白的表达量亦明显低于其他组。4.hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p过表达促进NAFLD的发展HepG2细胞铺于6孔板,每孔约1.2×106个细胞,培养12 h后,分别转染100 nM miRNA control、hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p到HepG2细胞,转染48 h后给予250μM PA诱导,诱导HepG2细胞24 h后,通过油红O染色发现,PA诱导组细胞内脂滴含量较PA未诱导组明显增多。通过Western blotting实验,检测PA诱导组以及PA未诱导组细胞中MST1的表达以及脂代谢途径相关调控分子的表达。数据显示与PA未诱导组相比,PA诱导组MST1、AMPK、pSREBP蛋白表达水平均明显下调。SREBP蛋白表达水平明显上调。通过甘油三酯含量测定发现细胞内PA诱导组细胞内TG含量亦明显升高。以上结果证明PA诱导组存在明显的肝脏脂质堆积现象,HepG2细胞的NAFLD模型构建成功。同时进行hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p干预实验,通过油红O染色,结果发现hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p干预组细胞内脂滴含量较其对照组存在着增加趋势。hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p干预组中MST1、AMPK、pSREBP蛋白表达水平较对照组存在着明显下调趋势,SREBP蛋白表达水平较对照组存在着明显上调趋势。细胞内TG含量明显升高,表明在细胞水平上,hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p通过调控人肝脏MST1基因的表达从而影响肝脏脂质代谢具有重要意义。5.NAFLD病人组和NAFLD对照组的样本中hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p存在明显的表达差异脂肪组织分泌的多种miRNA主要是通过血液循环作用于肝脏组织,故我们从临床上分别收集了同一病人的血清、脂肪组织以及肝脏组织。肝脏组织的HE染色为NAFLD主要的确诊依据,辅助临床B超检查以及血液学生化检查等指标,确定NAFLD组样本共13例,NAFLD对照组共11例。通过qPCR检测分别检测血清、脂肪组织以及肝脏组织hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p的表达差异,发现NAFLD病人组较其对照组,分布于上述各组织或脏器的hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p的表达均明显增加,同时肝脏MST1基因的表达量明显下降。表明在人临床样本水平上,脂肪组织来源的hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p通过调控人肝脏MST1基因的表达从而影响肝脏脂质代谢具有重要意义。其结果与细胞水平一致。结论证实脂肪来源的hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p通过作用于肝脏MST1影响肝脏脂代谢。