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第一章烧伤血清诱导的巨噬细胞系RAW264.7释放TNF-α、HMGB1及lL-10的规律及意义目的：从细胞水平探讨烧伤血清处理的RAW264.7细胞释放炎症介质TNF-α、HMGBl、IL-10的规律及意义。方法：制备严重烧伤大鼠模型获取烧伤大鼠血清；采用小鼠RAW264.7巨噬细胞，分别以烧伤大鼠血清处理制备细胞模型；细胞随机分为两组：(1)正常血清处理组(2)烧伤血清处理组。两组的剂量效应分别用含有体积分数0％、5％、10％、20％的正常血清及烧伤血清的培养基与RAW264.7细胞系共培养24h，分别收取烧伤血清刺激组及对照组细胞培养上清，3500g离心后留取上清于-20℃保存备用。两组的时间效应分别以含有体积分数20％的正常血清及烧伤血清培养基分别培养RAW264.7细胞0h，4h，12h，24h，同上留取离心后的培养液上清。以上每组均设3个复孔，用双抗体夹心ELISA法测定RAW264.7培养上清中TNF-α和IL-10含量，Western blot分析RAW264.7细胞HMGBl的含量。结果：实验发现，正常培养的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞经不同体积分数的正常血清处理24h后TNF-α分泌量极低，而经不同体积分数的烧伤血清分别处理24h后RAW264.7细胞能分泌大量的TNF-α，(0.06±0.02ng／ml)，(0.14±0.03ng／ml)，(0.16±0.04 ng／ml)，(0.21±0.02ng／ml)(P＜0.05)；Western blot检测发现，发现①正常RAW264.7巨噬细胞中有少量HMGBl表达；②应用正常SD大鼠血清干预RAW264.7细胞，发现HMGBl的表达量与正常RAW264.7巨噬细胞HMGBl表达量无显著差异，无统计学意义(P＞0.05)；③应用烧伤血清干预的RAW264.7巨噬细胞，其HMGBl的表达量至18小时达到高峰，至24小时仍维持高水平表达。烧伤血清诱导RAW264.7的IL-10分泌量与烧伤血清浓度无显著的剂量依赖性关系，经ELISA法测定，无烧伤血清对照组RAW264.7细胞IL-10分泌量极低，烧伤血清组在培养24h后RAW264.7分泌IL-10量逐渐升高。结论：烧伤血清能以时间和剂量依赖方式诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的TNF-α的分泌增加，以时间依赖方式诱导HMGBl和IL-10的分泌增加。第二章热休克反应对烧伤大鼠的保护作用及对烧伤血清诱导的巨噬细胞TNF—a，IL—10及HMGBl的影响目的：探讨HSR对烧伤大鼠的保护作用及对烧伤血清诱导的TNF-α、IL-10和HMGBl的影响。方法：制备烧伤大鼠模型，观察72h内死亡率；伤后6h取各组动物血清观测各项血清学指标，一部分大鼠于HSR(42℃，15min，室温下恢复24h)后再进行烧伤，24h后摘取肝、肺组织行病理切片检查。将传代RAW264.7细胞随机分为三组：(1)正常血清处理组。(2)烧伤血清处理组。(3)热休克预处理后烧伤血清处理组：热休克(HSR)处理：将细胞置于42℃的水浴箱中热休克1h，然后在37℃恢复12h，然后加入烧伤血清处理。三组的剂量效应分别用含有体积分数0％、5％、10％、20％的正常血清及烧伤血清的培养基与小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7共培养24h，分别收取烧伤血清刺激组及对照组细胞培养上清，3500g离心后留取上清备用。三组的时间效应分别以含有体积分数20％的正常血清及烧伤血清的培养基分别培养RAW264.7细胞0h，4h，12h，24h，同上留取离心后的培养液上清，以上每组均设3个复孔。用双抗体夹心ELISA法测定RAW264.7培养上清中TNF-α和IL-10含量，Western blot分析HMGBl的含量，RT-PCR检测TNF-αmRNA的表达、IL-10mRNA的表达。结果：大鼠严重烧伤后72h存活率为40％，较对照组明显下降(P＜0.05)；HSR组大鼠烧伤后存活率为60％，较单纯烧伤组明显上升(P＜0.05)；大鼠严重烧伤后6h血清中细胞因子TNF-α水平较伤前明显升高，IL-10水平稍增高，HSR后与烧伤组比较，IL-10水平升高，TNF-α水平下降，显示HSR明显抑制大鼠严重烧伤后血清中TNF-α水平，并上调IL-10水平。细胞在经热休克预处理后能抑制烧伤血清诱导的HMGBl释放，热休克预处理后(热休克后恢复1h)再给予烧伤血清刺激，TNF-αmRNA水平表达逐渐降低，细胞经热休克预处理后上调IL-10mRNA的表达。结论：HSR抑制烧伤血清诱导的RAW264.7细胞HMGBl释放和TNF-αmRNA的表达；HSR上调烧伤血清诱导的RAW264.7细胞IL-10mRNA的表达。第三章HSFI过表达对RAW264.7巨噬细胞TNF-a，IL-10及HMGBl基因表达的影响目的：探讨热休克因子1(heat shock factorl，HSFl)过表达对烧伤血清处理的巨噬细胞炎症介质TNF-α、高迁移率族蛋白-1(HMGBl)、IL-10基因表达的影响。方法：制备严重烧伤大鼠模型，获取烧伤大鼠血清；构建HSFl基因的真核表达载体，继而将HSF1真核表达载体转染RAW264.7巨噬细胞，建立稳定转染HSFl的巨噬细胞株，最后将转基因细胞经烧伤血清处理，探讨HSFl过表达对烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞TNF-a，HMGBl和IL-10基因表达的影响。结果：建立了稳定表达HSFl的RAW264.7细胞株，在该细胞株中有HSFl的部分活化；RT-PCR检测发现，正常血清处理的RAW264.7巨噬细胞中没有发现TNF-αmRNA和HMGBl mRNA的表达，而烧伤血清刺激能明显诱导TNF-αmRNA和HMGBl mRNA表达；与转空载体相比，HSFl过表达可明显抑制烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞中TNF-αmRNA和HMGBl mRNA的表达；正常情况下IL-10 mRNA在RAW264.7巨噬细胞中有少量表达，而烧伤血清处理能诱导IL-10 mRNA表达增加；与转空载体相比，HSFl过表达对烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞IL-10 mRNA的表达具有上调作用。结论：HSFl过表达可以抑制烧伤血清诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-a mRNA和HMGBlmRNA的表达，同时上调IL-10 mRNA的表达。第四章HSFl对IL-10的转录调控研究目的：探讨HSFl对IL-10的转录调控机制。方法：合成IL-10基因启动子区含HSE位点的寡核苷酸探针进行凝胶滞留实验(EMSA)，分析HSFl与IL-10基因启动子区的HSE的结合情况，并构建IL-10基因启动子的萤光素酶报告基因质粒，与HSFl表达质粒共转染RAW264.7细胞，检测萤光素酶活性，观察HSFl转染对启动子活性的影响。结果：生物素标记的HSFl结合片段(-376bp～-369bp)和核蛋白提取物孵育后能观察到阻滞带，阻滞现象能够被自身非标记探针竞争，但不被非标记的突变探针竞争，加入HSFl单克隆抗体，可以观测到超阻滞带，表明HSFl可以特异性结合于“HSFl识别序列”，HSE核心结合位点突变后，相对萤光素酶活性突变体(34.23±2.14)相对野生型(110.09±5.48)下降3.2倍，P值＜0.01，通过EMSA证实了IL-10启动子区域(-688bp～+64bp)存在HSFl的结合位点HSE(-376bp～-369bp)；突变体双萤光素酶活性分析发现HSFl的结合位点核心碱基的突变，其转录活性下降。结论-HSFl可以特异性结合于IL-10启动子区HSE(-376bp～-369bp)，相对萤光素酶活性分析提示HSFl可以转录激活IL-10，上调其表达。