研究背景与目的结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是常见的一种恶性肿瘤,全球每年约有100万新增病例。当前,CRC患者难以早期诊断;治疗方法虽有明显进步,但是仍不能满足临床需要,尤其对中晚期的患者更是治疗乏术。因此,进一步研究CRC发生发展的分子机制、发展更有效的诊治策略具有重要意义。S100A6(Calcyclin,钙周期蛋白),是S100家族的成员之一,参与调控细胞的增殖分化及蛋白磷酸化等进程。前期研究发现,外源性重组人S100A6蛋白可增加肿瘤细胞内的S100A6蛋白水平,提示肿瘤微环境中的S100A6可能参与调节肿瘤细胞内的S100A6表达。也有研究报道,S100A6高表达与β-catenin的升高常常同时存在于肿瘤中,且S100A6是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因;我们近期研究发现,S100A6可以增加多种肿瘤细胞中的β-catenin水平,这些结果初步提示微环境中的S100A6可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路正向调控肿瘤细胞S100A6的表达。因此,本研究将以人结直肠癌细胞HCT116及SW480为研究对象,探讨微环境中的S100A6是否正向调控CRC细胞中S100A6基因的表达、其机制是否涉及wnt/β-catenin信号通路的激活,以期为crc的发生发展机制及s100a6在crc发生发展中的作用的研究积累实验依据,也为crc的诊治提供新思路。方法1.重组人s100a6蛋白(recombinanthumans100a6,rhs100a6)的制备与验证:将重组质粒pgst-hrv3c-hs100a6及pgst-hrv3c分别化转至感受态细菌e.colibl21中,在lb培养基中培养扩菌,异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside,iptg)分别诱导表达融合蛋白谷胱甘肽s转移酶-人鼻病毒3c蛋白酶酶切序列-hs100a6(glutathionestransferase-humanrhinovirus3cproteasecleavagesite-hs100a6,gst-clvhrv3c-hs100a6)及重组蛋白谷胱甘肽s转移酶-人鼻病毒3c蛋白酶(glutathionestransferase-humanrhinovirus3cprotease,gst-hrv3c)。冰上超声破菌后,谷胱甘肽-琼脂糖4b球珠(glutathionesepharose4bbeads,gs4bb)分别分离纯化上述两种融合蛋白,随后gst-hrv3c酶切gst-clvhrv3c-hs100a6(4℃),再经gs4b球珠纯化,以去除其中的gst-hrv3c酶和切下的gst,即可获得重组rhs100a6蛋白。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)、考马斯亮蓝染色和westernblot鉴定,分光光度仪测定所得重组蛋白的浓度,再分装并于-80℃保存备用。2.融合蛋白gst-hs100a6蛋白(gst-hs100a6)的制备与鉴定:将重组质粒pgst-moluc-hs100a6及pgst-moluc分别化转至感受态细菌e.colibl21中,在lb培养基中培养扩菌,iptg分别诱导表达融合蛋白gst-hs100a6及gst。冰上超声破菌后,gs4b球珠分别分离纯化,得到上述两种蛋白。经sds-page、考马斯亮蓝染色和westernblot鉴定,分光光度仪对所得重组蛋白进行定量,分装并于-80℃保存备用。3.重组腺病毒的扩增及验证:通过hek293细胞扩增携带人β-catenin基因的重组腺病毒(adβ-cat)及其对照腺病毒(adgfp)、携带人β-catenin的sirna基因的重组腺病毒(adsiβ-cat)及其对照腺病毒(adrfp),并将扩增所得重组腺病毒分别感染人crc细胞系hct116和sw480,经rt-pcr及westernblot验证这些重组腺病毒感染crc细胞的有效性。4.rhs100a6对人crc细胞系hct116、sw480中s100a6表达的影响及相关机制的探讨:4-1rhs100a6对人crc细胞系hct116、sw480中s100a6基因表达的影响:rhs100a6蛋白(10μg/ml)分别处理hct116、sw480及正常肠上皮细胞fhc后,采用rt-pcr检测细胞s100a6mrna的水平;rhs100a6(10μg/ml)及gst-hs100a6(100μg/ml)分别处理hct116、sw480,并以gst为对照,通过westernblot检测这些细胞中s100a6的蛋白水平。4-2rhs100a6对人crc细胞系hct116、sw480中β-catenin的影响:rhs100a6(10μg/ml)分别处理hct116、sw480后,采用rt-pcr检测细胞β-cateninmrna水平,用westernblot分别检测胞浆、胞核及全细胞中的β-catenin水平,用免疫细胞化学(immunocytochemistry,icc)及细胞免疫荧光法检测细胞中β-catenin的表达与分布变化。4-3wnt/β-catenin通路活性的变化对rhs100a6上调人crc细胞系hct116、sw480中s100a6基因转录作用的影响:(1)验证wnt/β-catenin通路可调控s100a6的表达:将adβ-cat及adgfp、adsiβ-cat及adrfp分别感染hct116、sw480,采用rt-pcr及westernblot检测细胞中s100a6的表达水平;(2)下调wnt/β-catenin通路活性对rhs100a6上调人crc细胞系hct116、sw480中s100a6基因转录的影响:设置blank组、adrfp组、adsiβ-cat组、rhs100a6组、adsiβ-cat+rhs100a6共5个实验组,采用rt-pcr及qrt-pcr检测各组细胞中s100a6mrna的水平。4-4干扰wnt/β-catenin通路活性后对s100a6促crc细胞增殖迁移的影响:实验分组同方法4-3(2),通过adsiβ-cat阻断crc细胞中wnt/β-catenin通路,采用mtt、划痕愈合试验和transwell(无基质胶)试验检测细胞的增殖和迁移能力。5.rhs100a6影响β-catenin入核的相关机制:rhs100a6分别处理hct116、sw480后,采用westernblot分别检测细胞中p-akt(ser473)、p-akt(ser308)、t-akt、p-gsk3β、t-gsk3β的蛋白水平。结果1.制备的重组蛋白rhs100a6和gst-hs100a6经sds-page显示其相对分子质量分别约为10kd和36kd,符合预期。同时,westernblot证实这两种重组蛋白均能被s100a6单克隆抗体特异识别。2.扩增的adβ-cat、adsiβ-cat分别感染hct116、sw480细胞后,rt-pcr及westernblot检测结果一致提示β-catenin水平分别出现相应的上调和下调。3.外源性s100a6通过激活人crc细胞中wnt/β-catenin信号通路正向调控s100a6基因的表达:3-1rhs100a6分别处理hct116、sw480和fhc细胞后,前两种细胞中的s100a6mrna水平均上调(p<0.01),而fhc细胞中的s100a6mrna无明显变化(p>0.05)。rhs100a6与gst-hs100a6蛋白分别处理hct116、sw480后,细胞中的s100a6蛋白水平均上调。提示外源性s100a6可正向调控crc细胞中s100a6的表达。3-2rhs100a6处理hct116、sw480后,两种细胞中的β-cateninmrna水平无明显变化,但胞核中β-catenin与细胞中总的β-catenin蛋白水平上调(p<0.05),icc和细胞免疫荧光结果也一致证实crc细胞中β-catenin增加并向胞核聚集。提示外源性s100a6可激活crc细胞中wnt/β-catenin信号通路。3-3adβ-cat和adsiβ-cat分别感染hct116、sw480后,两种细胞中的s100a6的mrna和蛋白均出现相应的上调或下调。证实wnt/β-catenin信号通路参与调控crc细胞中s100a6基因的表达,即s100a6是该信号通路的靶基因。3-4adsiβ-cat与rhs100a6联合处理组的s100a6mrna水平明显低于单独rhs100a6处理组(p<0.01)。提示干扰β-catenin后能部分逆转rhs100a6的促hct116和sw480细胞中s100a6基因转录的作用。进一步证明微环境中的s100a6对crc细胞中s100a6基因表达的正向调控机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的激活。3-5 Adsiβ-cat与rhS100A6联合处理组细胞的增殖及迁移能力均低于rhS100A6单独处理组(P<0.01),表明下调Wnt/β-catenin信号通路后S100A6的促CRC细胞增殖迁移能力明显减弱。该结果除支持S100A6促CRC增殖迁移的作用及其机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的激活外,同时也支持我们的假设,即该通路参与介导微环境中S100A6对CRC细胞中S100A6的正向调控,因此下调该通路,便可部分阻断外源性S100A6对CRC细胞中S100A6基因自身表达的正向调控,进而部分阻断外源性S100A6促CRC细胞增殖迁移的作用。4.rhS100A6处理HCT116、SW480后,细胞中p-AKT(Ser473)、p-GSK3β水平均上调(P<0.01)。提示外源性S100A6可能通过激活AKT信号通路而促进β-catenin入核。结论1.微环境中的S100A6对CRC细胞中S100A6的表达具有正向调控作用,其机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的激活。2.微环境中的S100A6可能通过激活AKT信号通路促进CRC细胞浆中的β-catenin入核。