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牛病毒性腹泻病(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一类以腹泻、流产、呼吸道疾病和免疫机能障碍为主要症状的疾病,目前已在世界范围内广泛传播,给养牛业国家造成了巨大的经济损失。我国BVDV感染具有特征性临床症状的病例并不多见,多半是隐性感染,未能引起足够重视。BVDV感染胎盘组织,通过胎盘屏障将病毒传播给胎儿,造成母胎持续性感染是该病防治的难点和重点。妊娠母畜在怀孕早期通过子宫内感染非致细胞病变型(ncp) BVDV,此时胎儿免疫系统尚未成熟,不能产生免疫应答反应。此种牛一出生即为持续感染牛,外表健康,但终生带毒、排毒,成为畜群主要的传染源。胚胎滋养层细胞是母体和胎儿的联系纽带,同时也是BVDV垂直传播的靶细胞,目前有关BVDV感染胚胎滋养层细胞的分子机制尚不清楚。寻找与BVDV主要囊膜蛋白相互作用的细胞受体,确定受体在病毒感染细胞过程中的功能,是研究BVDV垂直传播机制的重要内容之一,也为家畜抗病育种提供新的理论依据。为此,本研究以BVDV和胚胎滋养层细胞为研究对象,主要展开以下研究工作：1.新疆部分地区奶牛场BVDV的分子流行病学调查和基因型分布。根据BVDV保守区基因5’-UTR设计引物,采用RT-PCR方法,对新疆石河子、玛纳斯、喀什、等7个地区、14个奶牛场的274份牛粪样品进行核酸检测及测序。结果表明：BVDV阳性率为18.61%(51/274),北疆地区阳性率为21.34%(51/239),南疆地区未检测出病原。其中有23对母子对应样品,母牛阳性率为39.13%(9/23),犊牛阳性率为30.43%(7/23)。35头牛表现临床症状,阳性率为45.71%(16/35),其余为临床健康牛,阳性率为17.16%(35/204)。调查数据显示新疆地区奶牛BVDV存在隐性感染,且垂直感染较严重。通过序列比对,系统发生分析表明所分析序列与已公布的BVDVⅠ型序列核苷酸同源性最高,达97.5%,并且主要是BVDVⅠb亚型。对临床发病症状明显的初检阳性病料进一步分离培养和鉴定。采用免疫学实验、细胞培养和电镜观察、理化特性测定以及同源性比较等方法分离、鉴定了1株BVDV分离株,命名为BVDVshz132株。2.牛胚胎滋养层细胞体外分离培养及BVDV shz132株感染实验：采用胶原酶消化方法,从牛子叶组织中分离双核滋养层巨细胞(Binucleate trophoblast giant cells,TGC)。实验分离的细胞经台盼蓝染色后记录细胞存活率大于90%,核染可见典型双核特征；经差异贴壁法纯化后纯度可达95%。抗细胞角蛋白抗体检测呈阳性,抗波形蛋白抗体检测呈阴性。细胞经过4次传代后,可以存活60天。通过制备细胞爬片,接种BVDVshzl32株,分别培养12-60h,采用BVDV5’-UTR基因实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数在培养12h和60h的增殖情况。结果表明60h病毒拷贝数明显高于12h,病毒可在TGC细胞中复制、增殖。3.建立牛胚胎滋养层细胞的cDNA文库,采用酵母双杂交技术筛选与BVDVshzl32株主要囊膜蛋白E2相互作用的TGC细胞结合蛋白。文库的库容为1.3×106,插入片段大小在0.2-4kb；取杂交后35个克隆进行测序,用BlastN进行序列同源性比对,筛选得到与BVDV感染TGC细胞相关的捕获蛋白有Bos taurus tryptophanyl-tRNA synthetase (色氨酰-转移核糖核酸合成酶)、similar to WARS protein(色氨酸-转移核糖核酸合成酶--TRRRS-基因标记符号)、actin and beta (肌动蛋白)、p21 protein (Cdc42/Rac)-activated kinase 4(p21-活性激酶,PAK4)、pyruvate kinase(丙酮酸激酶)和clathrin heavy-chain(网格蛋白重链)。通过在线软件分析捕获蛋白的二级结构,预测各个蛋白结构域的功能。结果发现网格蛋白重链接头蛋白(heavy-chain linker)介于网格蛋白与配体-受体复合物之间起到连接作用,通过网格蛋白包被囊泡的内吞作用使配体-受体复合物进入细胞。分析表明网格蛋白介导的内吞作用是BVDV感染细胞的一种途径。采用免疫共沉淀方法验证网格蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。以上研究结果表明：通过对新疆地区的BVDV流行病学调查发现,本地区阳性感染率较高,垂直传播严重,基因型分布主要以BVDVIa和Ib型为主。对流行病学阳性样品进一步分离,鉴定了一株BVDV野毒株(shz132株),为非致细胞病变型；成功体外培养了牛胚胎滋养层巨细胞,对细胞进行了鉴定,并成功感染BVDV shz132株；构建了牛胚胎滋养层细胞的cDNA文库；通过酵母双杂交筛选得到6个与BVDV shz132株E2蛋白相互作用的牛胚胎滋养层细胞蛋白,其中网格蛋白是与BVDV感染滋养层细胞相关的蛋白。通过本研究,为揭示BVDV垂直传播,导致持续性感染的分子机制提供线索,也为该病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。