嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种广泛分布各种水体中的革兰氏阴性菌,也是一种典型的原发性条件致病菌。该菌可分泌多种毒力蛋白侵染宿主,导致机体出现病变,轻则引起腹泻、呕吐,重则出现败血症、胆囊炎等症状。鱼类尤其易被该病原菌感染,目前防治此类鱼病的方法主要通过抗生素,但抗生素的过度使用势必增加该菌的耐药性,不仅制约了养殖业的发展,也增加了防治该类鱼病的难度,同时还会对水生产品、生态环境造成严重的破坏,从而威胁到食品安全与社会公共安全。外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)是一类位于革兰氏阴性细菌外膜上的蛋白质,可协助细菌摄取所需的营养物,促进细菌的生长,并在细菌的生理与病理机制中扮演着重要作用。而外膜蛋白的合成、转运与正确折叠则需要经历一个复杂的过程,先在细胞质内合成具有N-末端信号的前体,经由SEC系统介导穿过细胞内膜,并在分子伴侣(Skp,SurA)的作用下经过周质空间,最终在BAM(β-barrel assembly machinery)复合物的协助下正确地折叠和整合到外膜中形成β-桶状结构。研究发现BAM复合物一般由BarmA-E等5个亚基组成,在外膜蛋白的合成与分泌过程中扮演着极其重要的作用。而目前对于该复合物的研究仅局限于少数几种菌中,在其他细菌中的相关功能还有待进一步研究。本论文以嗜水气单胞菌ATCC 7966为研究菌株,通过构建bamA、B、C缺失株以及BamA蛋白的琥珀酰化修饰研究其对于嗜水气单胞菌重要生理功能的影响。首先利用同源重组技术,对bamA、B、C的上下游同源臂进行体外PCR扩增,在经历两次同源重组的氯霉素筛选抗性的正向选择与SacB负向复筛过程,获得目的缺失菌株AbamA、B、C。随后通过SDS-PAGE分析、PCR、16sDNA测序等技术手段检验缺失菌株的正确性。为了研究BAM系统关键蛋白缺失株对嗜水气单胞菌重要生理功能的影响,本论文首先对缺失株在盐酸土霉素(Oxytetracycline,Oxy)、环丙沙星(Ciproxacin,Cip)、四环素(Tetracycline,Tet)、萘啶酸(Nalidixic acid,Na)中的最小抑菌浓度(MIC)进行测定。结果发现,相对于野生菌株,⊿bamA在这四种抗生素下耐药性均有不同程度升高,其中在Oxy中的耐药性最为显著;⊿bamB对于Cip的MIC有升高、而⊿bamC对Na的MIC显著升高;其次测定缺失株与野生株在这四种抗生素处理下的生长曲线,结果显示⊿bamA缺失株在Oxy、Cip、Tet、Na的胁迫下,生长状态均有不同程度的差异,⊿bamB仅在Oxy处理下有变化,然而⊿bamC仅在Na处理有差异。然后通过细胞溶血性与胞外蛋白酶活性检测,发现bamA-C缺失菌株显著减少细菌胞外蛋白酶分泌活性,而溶血性却出现相对增强的现象。为进一步证实上述缺失株表型的变化可能与BAM系统缺失后对外膜蛋白转运的影响有关。本论文利用Western blotting技术,研究bamA-C缺失菌株中,A0KQZ1、A0KHF6、A0KQ46及A0KHF7等4个外膜或膜蛋白在细菌胞浆和膜蛋白组分中的表达情况。结果发现,与野生株嗜水气单胞菌相比较,bamA、B、C缺失后均导致膜蛋白表达下降,且⊿bamA与⊿bamC的变化最为显著,提示BamA-C蛋白在细菌膜蛋白转运与调控中起重要的作用。此外,前期课题组修饰蛋白质组学研究发现,BamA的K558赖氨酸位点发生了琥珀酰化修饰。为了进一步研究琥珀酰化修饰位点对嗜水气单胞菌生理功能的影响,本论文通过基因重组的方法构建bamA缺失株的回复株,并利用定点突变技术将相应赖氨酸修饰位点突变为558R。研究结果发现,BamAK558R位点突变对嗜水气单胞菌盐酸土霉素的耐药性有显著的影响。生长曲线分析也发现点突变后的菌株生长速率低,进入平台期的时间更长。同时还发现此位点对于胞外蛋白酶活性也存在一定的抑制作用。综上所述,本论文通过分子生物学方法构建了嗜水气单胞菌的bamA、BB、C缺失株与bamA位点突变与回复菌株。研究发现BamA、B、C蛋白影响细菌的耐药性、溶血性、胞外蛋白酶等生理功能,同时还发现BamA蛋白K558位点的琥珀酰化修饰在细菌耐药性中起重要作用。通过以上研究,为深入了解BAM系统在嗜水气单胞菌中的生物学功能提供了初步的理论依据。