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水溶性的天然多糖以及经过化学修饰的这些多糖具有许多独特的生物活性,引起了人们的广泛关注。通过对多糖的化学修饰,引入一些特定的化学基团,在一定程度上改变了多糖的结构、理化性质、及生物活性。这对于多糖构效方面的研究及药物开发具有重要的意义,因此这一领域成为近年来研究的热点。 我们以黄芪根粉为起始原料,通过醇煮—水煮—醇沉的工艺方法提取得到含有蛋白质的水溶性黄芪粗多糖(含氮量为2~3%),分别采用了三氯乙酸法、酶(胰蛋白酶)法、Sevage法及酶-Sevage联合法,对粗黄芪多糖进行脱蛋白。结果显示酶-Sevage联合法脱蛋白的效果最好,得到含氮量为0.05%的黄芪纯多糖。利用部分酸水解的方法将难溶性淀粉转变为可溶性的淀粉,数均分子量为1.0~2.0×10~4。 采用了四种方法对黄芪纯多糖和部分酸水解淀粉进行了乙酰化修饰,方法一:利用浓硫酸作催化剂,冰醋酸、乙酸酐作乙酰试剂,与多糖在60℃的水溶液中反应1h。方法二:乙酸酐作为乙酰化试剂,2.25mol/l的NaOH控制反应体系的pH为9~10反应1h。方法三:以DCC为脱水剂,冰醋酸为乙酰化试剂,DMAP为催化剂在40℃下反应48h。方法四:以甲磺酸MSA为催化剂,冰醋酸、乙酸酐为乙酰化试剂,与多糖在75℃的水溶液中反应1.5h。四种方法所得的乙酰化产物利用羟胺比色法,在分光光度计上测定了其乙酰化度。四种方法所得的乙酰化产物的乙酰化度的范围分别是0.15~0.25、0.30~ 内蒙古大学硕士学位论文0.40、0.05一0.30、0.50一0.70。对方法一的研究结果表明,乙酞化度随冰醋酸与水的比例的增高而增大。对方法三的研究表明,乙酞化度随反应温度的升高而降低,随催化剂量的增大而增高,在一定的反应时间内随时间增高,之后随反应时间下降。 对于黄茂多糖、黄茂多糖的乙酞化物、部分酸水解淀粉、及其乙酞化物用三氧化硫毗咤法进行了硫酸化。通过控制反应温度、硫酸化试剂的用量、反应时间等实验条件,得到了不同硫酸度的硫酸化黄茂多糖。但在相同的反应条件下,对不同乙酞化度的黄蔑多糖及部分酸水解淀粉进行硫酸化,得到了不同硫酸化度的两种多糖的化学修饰物,且硫酸化度都随着原来多糖链上乙酞化度的降低而增高。这点表明,多糖链上的乙酞化和硫酸化存在着相互的竞争性,而不是达到糖环C2、C3、C6上轻基酷化的饱和性。本论文还应用了HPLC,采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定了各多糖高分子的分子量;采用离子色谱法测定了各硫酸化多糖的硫酸化度。用运红外(工R)、核磁共振(’HNMR、‘3HNMR)对上述多糖及化学修饰物进行了结构表征。利用甲基红的钠盐为内标物定量地与硫酸化乙酞化黄茂多糖混和,进行‘HNMR测定,利用二者的甲基峰积分比值,确定出乙酞化硫酸化黄茂多糖的乙酞化度。 通过体内实验凝血时间(CT)测定、体外实验凝血酶时间(TT)的测定,对比研究了黄茂多糖、部分酸水解淀粉以及它们的硫酸化乙酞化修饰物的抗凝血活性。体内实验凝血时间(CT)测定结果表明,与生理盐水对照组测定结果相比,黄茂多糖、部分酸水解淀粉及其乙酞化物对小鼠的凝血时间没有明显的影响,而硫酸黄茂多糖显著地延长了小鼠的凝血时间。乙酞化硫酸化黄茂多糖、硫酸化部分酸水解淀粉也对小鼠的凝血时间有所延长,但没有硫 内蒙古大学硕士学位论文酸化黄茂多糖显著。不同的乙酞基取代度、不同的硫酸化度的黄茂多糖系列衍生物,对小鼠的凝血时间随硫酸化度增高而延长。随着乙酞基取代度的降低硫酸化度升高,从而使凝血时间延长。体外实验凝血酶时间的测定结果表明,黄茂多糖显示出一定的抗凝血活性;对于不同乙酞化度的黄茂多糖、部分酸水解淀粉,凝血酶时间与浓度、乙酞化度都没有相互的依赖性。黄茂多糖、部分酸水解淀粉的硫酸化修饰物都不同程度地使凝血时间延长,且对硫酸化黄茂多糖的浓度、硫酸化取代度存在明显的量效关系。 综上所述,黄茂多糖具有一定的抗凝血活性,部分酸水解淀粉没有此活性。但两种多糖硫酸化后,具有非常显著的抗凝血活性。且抗凝血活性随硫酸化度和浓度的增大而增强。两种多糖乙酞化后,均不存在抗凝血活性。硫酸化乙酞化黄茂多糖抗凝血活性随硫酸化度增加而增强,抗凝血活性与乙酞化度没有直接关系,但乙酞化取代度影响着硫酸化取代度,间接地对硫酸化乙酞化黄茂多糖的抗凝血活性有所影响。