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盘羊(Ovisammon)属于国家二级保护动物，具有较强的抗病力，而其杂交后代羊表现出抗病力弱，推测杂交羊抗病力弱可能与某些抗病基因变异相关。类泛素基因ISG15是疾病相关抗性基因的一种，在机体先天性免疫方面发挥着重要的作用。因此，推测可能由于ISG15基因变异而导致杂交羊先天性免疫降低。目的：本研究通过表达盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的ISG15基因，研究重组ISG15蛋白对淋巴细胞增殖、凋亡的影响及对体外支原体感染的影响，比较父母代羊及杂交羊之间ISG15表达水平的差异，以揭示类泛素蛋白ISG15的功能，阐明其在疾病抗性中的作用。方法：（1）盘羊、巴什拜羊及其杂交羊ISG15基因的真核表达：首先从重组克隆载体pMD18-T-ISG15中扩增出盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的ISG15基因，将以上三种羊的ISG15基因分别亚克隆到巴斯德毕赤酵母pPIC9K表达载体中，再分别将重组质粒通过电击转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株，利用PCR方法鉴定出阳性转化子，然后用0.5%甲醇诱导重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达蛋白；最后利用SDS-PAGE验证蛋白表达。（2）盘羊、巴什拜羊及其杂交羊类泛素ISG15基因的表达产物的纯化：对三种羊重组类泛素ISG15蛋白采用Ni2+螯合亲和层析法进行纯化，利用SDS-PAGE对纯化产物进行检测。（3）盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的重组类泛素ISG15蛋白对淋巴细胞增殖的影响：从健康细毛羊颈静脉采血，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，进行细胞培养，分别加入纯化的三种羊的重组类泛素ISG15蛋白，采用MTT法检测三种羊重组类泛素蛋白ISG15对淋巴细胞的增殖效果。（4）盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的重组类泛素ISG15蛋白对淋巴细胞凋亡的影响：培养羊的淋巴细胞，利用试剂提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳法进行凋亡检测。（5）盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的重组类泛素ISG15蛋白对体外肺炎支原体感染的影响：首先培养羊的淋巴细胞，再分别将三种羊的重组类泛素ISG15蛋白和绵羊肺炎支原体加入培养的淋巴细胞中，最后利用real-timePCR技术检测肺炎支原体16SrRNA的表达水平。（6）盘羊、巴什拜羊及其杂交羊淋巴细胞体外表达类泛素ISG15mRNA水平的检测：分别培养三种羊的淋巴细胞，加入绵羊肺炎支原体进行感染，利用real-timePCR技术检测类泛素ISG15mRNA表达水平。结果与结论：（1）成功构建了盘羊、巴什拜羊及其杂交羊ISG15的真核表达载体，并且成功在毕赤酵母中进行表达。（2）表达产物纯化后，经SDS-PAGE检测显示，观察到条带单一的目的条带，成功纯化了盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的重组类泛素ISG15蛋白。（3）当加入盘羊重组蛋白浓度为5、10、20、40和80μg/mL时，OD值均显著高于对照组（P<0.05）；当加入巴什拜羊的重组ISG15蛋白浓度为40和80μg/mL时，OD值显著高于对照组（P<0.05）；而加入杂交羊重组蛋白浓度为10、20、40和80μg/mL时，显著低于对照组（P<0.05）。说明盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白具有良好的促进淋巴细胞增殖活性，而杂交羊的重组ISG15蛋白促淋巴细胞增殖活性较差。（4）琼脂糖凝胶电泳结果显示未出现梯状条带。说明盘羊、巴什拜羊及其杂交羊的重组类泛素蛋白ISG15没有诱导淋巴细胞凋亡的作用。（5）在重组ISG15蛋白作用后的12h到96h，盘羊组和巴什拜羊组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平显著低于对照组（P<0.05），而杂交羊组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平与对照组差异不显著。说明盘羊及巴什拜羊的重组类泛素蛋白ISG15对绵羊肺炎支原体可起到抑制作用，杂交羊的重组类泛素蛋白ISG15对绵羊肺炎支原体无明显抑制效果。（6）在肺炎支原体感染后12h到96h，盘羊试验组和巴什拜羊试验组的类泛素ISG15mRNA表达水平显著高于盘羊对照组、巴什拜羊对照组和杂交羊试验组（P<0.05）。说明绵羊肺炎支原体的感染能够显著提高盘羊及巴什拜羊淋巴细胞表达ISG15mRNA的水平，而杂交羊淋巴细胞表达ISG15mRNA水平上升不明显。