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研究目的:膀胱癌(bladder cancer,BCa)是全球范围内最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居高不下。研究表明,环状RNA(circular RNA,circ RNA)在肿瘤进展中发挥重要作用,但其调控膀胱癌的作用机制尚未完全阐明。课题组前期通过高通量测序分析12对膀胱癌组织及癌旁组织中circ RNA的表达谱,发现环状RNA circEPB41L2在膀胱癌组织中呈低表达。基于前期成果,我们将circEPB41L2作为研究对象,拟进一步探究circEPB41L2对膀胱癌生存、迁移、侵袭和体内增殖能力的影响,揭示其在调控膀胱癌发生发展中的分子机制。研究方法:1)通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)在50对膀胱癌组织及对应癌旁正常组织中检测circEPB41L2的表达情况;体外培养膀胱癌细胞株和永生化膀胱上皮细胞SV-HUC-1,检测circEPB41L2在其中的表达水平。2)构建过表达circEPB41L2的慢病毒载体并转染入膀胱癌细胞株5637、T24中以构建稳转细胞株;通过PCR实验、抗RNase R酶降解实验及Sanger测序验证circEPB41L2慢病毒是否正确成环;通过核质分离实验及荧光原位杂交实验研究circEPB41L2在膀胱癌细胞株中的亚定位;通过存活实验、划痕实验、基质胶侵袭实验探究过表达circEPB41L2对膀胱癌细胞生存、迁移、侵袭能力的影响;使用si RNA沉默SV-HUC-1细胞中circEPB41L2的表达,通过存活实验、划痕实验探究circEPB41L2对SV-HUC-1细胞生存、迁移能力的影响。3)将过表达circEPB41L2的5637细胞接种至裸鼠的右侧腋窝皮下构建皮下成瘤模型,成瘤后测量瘤体大小并取瘤称重,探究circEPB41L2在体内对膀胱癌增殖能力的影响。4)通过生物信息学、蛋白质免疫印迹(Western blot)实验及蛋白质谱(LC-MS/MS)分析并验证circEPB41L2的蛋白编码能力,将该蛋白命名为circEPB41L2-240aa蛋白;通过免疫荧光实验检测circEPB41L2-240aa蛋白在膀胱癌细胞株中的亚定位;构建过表达circEPB41L2-240aa蛋白的质粒并转染入膀胱癌细胞株中,通过存活实验、划痕实验、基质胶侵袭实验探究上调circEPB41L2-240aa蛋白的表达对膀胱癌细胞生存、迁移、侵袭能力的影响。5)为了进一步探究circEPB41L2是否通过翻译circEPB41L2-240aa蛋白发挥作用,我们将翻译起始密码子突变的circEPB41L2-mutation慢病毒载体转染入膀胱癌细胞中,通过存活实验、划痕实验、基质胶侵袭实验探究失去蛋白翻译功能的circEPB41L2在膀胱癌中的生物学功能。研究结果:1)circEPB41L2在膀胱癌组织中的表达较癌旁正常组织低(p<0.01),在膀胱癌细胞株中的表达较SV-HUC-1细胞低(p<0.05)。2)通过PCR实验、抗RNase R酶降解实验及Sanger测序确认了circEPB41L2慢病毒可在膀胱癌细胞中过表达并正确成环;核质分离实验及荧光原位杂交实验证明circEPB41L2主要位于膀胱癌细胞的细胞质中;存活实验、划痕实验、基质胶侵袭实验证明过表达circEPB41L2可显著抑制膀胱癌细胞株5637、T24的生存(p<0.05)、迁移(p<0.01)和侵袭(p<0.01)能力;存活实验、划痕实验证明沉默circEPB41L2的表达可显著促进SV-HUC-1细胞的生存(p<0.05)及迁移(p<0.01)能力。3)裸鼠成瘤实验发现过表达circEPB41L2可显著抑制膀胱癌皮下移植瘤的瘤体重量(p<0.01)及肿瘤体积(p<0.05)。4)生物信息学分析发现circEPB41L2可以编码一段具有240个氨基酸的蛋白(约27KDa),Western blot实验结果证实过表达circEPB41L2的细胞在25~30KDa处存在明显条带,而空白对照组和circEPB41L2-mutation转染组没有条带;在25~30KDa波段的LC-MS/MS结果中,发现了一段由circEPB41L2编码的特异性蛋白序列“VTLLDGTEYSCDLEHK”;免疫荧光实验证明circEPB41L2-240aa蛋白主要分布在膀胱癌细胞的细胞质中;存活实验、划痕实验及基质胶侵袭实验证明上调circEPB41L2-240aa蛋白的表达可明显抑制膀胱癌细胞的生存(p<0.05)、迁移(p<0.01)及侵袭(p<0.01)能力。5)由于失去了编码circEPB41L2-240aa蛋白的能力,circEPB41L2-mutation虽仍具有抑制膀胱癌细胞生存、迁移及侵袭的能力,但其抑癌作用受到一定程度的抑制。研究结论:1)circEPB41L2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株中呈低表达,能显著抑制膀胱癌细胞的生存、迁移、侵袭能力和体内增殖能力。2)circEPB41L2的编码蛋白,即circEPB41L2-240aa,可显著抑制膀胱癌细胞生存、迁移及侵袭能力;但circEPB41L2失去编码蛋白能力后,其抑癌作用减弱,提示circEPB41L2-240aa部分参与了circEPB41L2调控膀胱癌的发生过程。