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本研究发现小鼠神经干细胞自身表达多种光敏感蛋白(photoreceptors),细胞及分子遗传系列实验证明:无需病毒载体转染外源基因,通过微弱蓝光(455nm,300μw/cm2)照射便可利用细胞内Melanopsin-TRPC6-Jabl分子信号通路,显著提升神经干细胞增殖分化行为。基于此体外实验结果,体内检测发现成年小鼠深部脑区的内源性神经干细胞同样表达此光感受/光信号转导通路,低剂量照射便可有效动员海马齿状回颗粒下区的内源性神经干细胞分化。进一步通过在小鼠深部脑区海马齿状回颗粒下区注射稀土元素掺杂的上转换纳米颗粒,于脑外侧进行近红外光(980nm)照射,在大脑深处诱导产生所需蓝光。结果显示该技术可以成功诱导静息态神经干细胞进行分化,实现了无需转基因/非侵入式内源性神经干细胞的体内原位动员。[研究目的]本课题主要针对如何在生物体内实现原位、非侵入式的光操控进行研究,实现通过非病毒转染/非侵入式光调控手段对神经干细胞的动员和功能重塑。[研究方法]1、利用RT-PCR技术检测神经干细胞表达多种光敏感蛋白;2、分离培养孕E13.5 C57BL/6野生小鼠的神经干细胞,利用单色蓝光(455nm,300 μW/cm2)、红光(635nm,300μw/cm2)及组合刺激后,分别检测细胞增殖与自我更新及分化指标变化;3、利用免疫荧光技术检测神经干细胞表面表达光敏感蛋白Melanopsin情况;利用全细胞膜片钳和钙离子探针技术蓝光(455nm)激活神经干细胞Melanopsin-TRPC6钙离子通道,利用Western Blot检测Melanopsin/TRPC6/Jabl光感受/光转导通路变化;4、利用免疫荧光检测内源性神经干细胞表达Melanopsin和TRPC6情况;利用25mW/10Hz的200μm蓝光光纤对C57BL/6野生小鼠SGZ区域的NSCs进行刺激,通过免疫荧光、Western Blot和RT-PCR对神经分化指标进行检测;5、将上转换纳米颗粒UCNPs注射入C57BL/6野生小鼠SGZ区域,近红外光在脑外侧进行照射,通过免疫荧光、Westem Blot和RT-PCR对神经分化进行检测。[实验结果]1、神经干细胞NSCs表达多种光敏感蛋白;2、单色蓝光(455nm,300μw/cm2)可以促进神经干细胞的增殖与自我更新,可以促进其向星形胶质细胞方向的分化,抑制其向神经元方向的分化;3、单色红光(635nm,300μw/cm2)可以抑制神经干细胞其向星形胶质细胞方向的分化,促进其向神经元方向的分化;4、利用免疫荧光和Westem Blot技术发现神经干细胞表面表达光敏感蛋白Melanopsin;用全细胞膜片钳技术发现单色蓝光可以激活Melanopsin-TRPC6钙离子通道;初步确定了 Melanopsin/TRPC6/Jab1的光感受/光转导通路;5、利用免疫荧光技术验证了 E13.5胎鼠、成年小鼠大脑SVZ和SGZ的NSCs表达 Melanopsin 和 TRPC6;6、通过200μm蓝光光纤刺激小鼠海马齿状回颗粒下区SGZ的神经干细胞,结果显示促进神经干细胞向胶质细胞方向分化;7、同时,利用近红外光(980nm)和上转化纳米颗粒UCNPs刺激小鼠体内神经干细胞,发现其同样可以实现促进神经干细胞向胶质细胞方向分化。[结论]本研究发现神经干细胞表达光敏感蛋白Melanopsin(Opn4),以此为科学依据利用单色光(455nm、635nm)在体外对神经干细胞行为进行调控,发现蓝光可以通过Melanopsin/TRPC6/Jab1光感受/光转导通路影响神经干细胞的增殖、自我更新和分化。在此基础上,本研究利用了蓝光光纤和近红外光照射实现了内源性神经干细胞体内原位动员。