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目的:构建稳定表达GFP的整合性布鲁氏菌M5和S19(以下简称GFP-M5和GFP-S19);比较GFP-M5和GFP-S19与正常布鲁氏菌M5和S19在巨噬细胞中的存活能力,证明GFP基因的转入不会影响后续试验的进行。分析GFP-M5和GFP-S19侵染巨噬细胞后与溶酶体、内质网和高尔基体结合产生阳性黄色荧光数量;分析GFP-M5和GFP-S19侵染小鼠巨噬细胞前期成功的数量;分析GFP-M5在特定时间内的传代培养过程中绿色荧光基因表达的丢失情况;观察GFP-M5感染小鼠后,脾脏切片的荧光表达情况,为布鲁氏菌在细胞内及小鼠体内的生存繁殖及致病机制的研究奠定了实验基础。方法:1、pMC-221载体电转化进入布鲁氏菌M5和S19的感受态细胞,检测成功后获得GFP-M5和GFP-S19。2、将布鲁氏菌M5和S19与GFP-M5和GFP-S19培养至对数期后收集菌体,用麦氏比浊的方法,按照细菌和细胞的比例为100:1进行侵染,利用平板计数法来比较正常细菌与GFP-布鲁氏菌在胞内存活的能力。3、用激光共聚焦显微镜观察GFP-M5和GFP-S19与巨噬细胞溶酶体、内质网、高尔基体的结合,分析两者与各细胞器结合产生阳性黄色荧光的数量。4、用流式细胞仪检测分析GFP-M5和GFP-S19侵染小鼠巨噬细胞各时期产生的GFP+巨噬细胞百分比。5、将GFP-M5分别放置含氯霉素抗性和不含氯霉素抗性的布鲁氏菌液体培养基中传代培养,将各传代时期的菌液侵染小鼠巨噬细胞后,用流式细胞仪检测并分析,绿色荧光蛋白基因丢失的情况。6、将GFP-M5和GFP-S19感染小鼠特定时间后,取出小鼠脾脏进行拍照分析和切片荧光显微镜下的观察。结果:1、通过对电转后的菌株进行PCR的鉴定,pMC-221成功转化至两种布鲁氏菌。2、通过CFU结果显示,GFP-M5和GFP-S19对比布鲁氏菌M5和S19在不同时间阶段的细菌计数无明显差异,两种菌株是否转化有pMC-221载体,对菌株侵染小鼠巨噬细胞的侵染能力没有影响。3、通过GFP-M5和GFP-S19对小鼠巨噬细胞的侵染,1h、2h、3h、4h爬片结果在激光共聚焦显微镜下的观察可以得出,两种菌株与小鼠巨噬细胞各细胞器结合能力并无显著差异,说明两者的侵染能力相当,4h以内在巨噬细胞中的复制、繁殖等能力相当。4、通过GFP-M5和GFP-S19侵染小鼠巨噬细胞流式细胞检测结果可以得知,30min时,两种菌株都已经进入巨噬细胞,在30min至6h的侵染过程中,两种菌株对巨噬细胞的侵染能力没有显著的差异,说明两种菌株在前6h的侵染能力与在巨噬细胞中的繁殖能力相当。5、通过荧光倒置显微镜的观察与分析,可以得知布鲁氏菌M5在侵染小鼠巨噬细胞后不会表达绿色荧光蛋白,而转化子GFP-M5菌株在侵染小鼠巨噬细胞后可以成功表达绿色荧光蛋白,说明GFP基因表达成功。通过各个时间段的GFP-M5对小鼠巨噬细胞侵染,流式细胞仪对GFP+巨噬细胞百分比测定得知,培养基中是否含有氯素抗性,这个因素不会影响GFP-M5绿色荧光蛋白基因的丢失,从而又可以看出,GFP-M5菌株传代培养过程中,绿色荧光蛋白都没有丢失表达的现象,说明在此时间段内,GFP-M5菌株的荧光表达和对其的观察不会受到影响,也奠定了GFP-布鲁氏菌感染小鼠机体,通过小鼠机体对GFP-布鲁氏菌直接观察与试验奠定了良好的基础。6、从小鼠脾脏的解剖观察可以看出,感染过GFP-M5的小鼠较健康的小鼠脾脏颜色较深。通过感染后的小鼠脾脏切片的观察可以看出,GFP-M5和GFP-S19感染后的小鼠脾脏中,都可以观察到表达了绿色荧光蛋白的布鲁氏菌,说明布鲁氏菌已经侵染进入到了脾脏中的巨噬细胞内。结论:本试验结果表明布鲁氏菌M5和S19在小鼠巨噬细胞前期的复制、繁殖等能力相当;在30天传代的时间中,GFP基因片段的表达并没有丢失的现象,这为表达绿色荧光的布鲁氏菌侵染活体动物的研究提供了实验基础;布鲁氏菌感染小鼠一周后,在荧光显微镜下的小鼠脾脏中可以观察到表达绿色荧光的布鲁氏菌,为布鲁氏菌在活体动物中荧光表征层面研究奠定了基础。