研究背景及目的脑胶质瘤是中枢神经系统常见的原发性肿瘤之一,约占颅内肿瘤的40%～60%,尤其是恶性脑胶质瘤,具有远处侵袭性,恶性程度高,目前在神经外科手术技术、影像诊断技术、放疗化疗等方面尽管取得了很大的进步,但患者临床治疗效果仍不尽人意,治愈率低且易复发,死亡率高,其主要原因之一是患者自身抗肿瘤免疫功能低下,如何提高患者抗肿瘤免疫机能是胶质瘤治疗研究中的主要问题之一。随着对脑胶质瘤免疫学特性的深入研究和生物技术的发展,探索各种胶质瘤主动免疫疫苗成为生物免疫治疗中关注的热点。当前,治疗性脑胶质瘤疫苗主要有以下几类:一是树突状细胞(dendritic cell,DC)为基础的疫苗,二是肿瘤细胞的瘤苗,三是基于病毒载体的溶瘤疫苗。其中肿瘤细胞疫苗是目前主要的研究方向。本课题研究的是大鼠白介素-12基因(rIL-12)和人类Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因(HSV-TK)共同修饰大鼠胶质瘤9L细胞构建的9L-rIL-12/TK可控性“活”细胞疫苗。此疫苗细胞具有较完全的肿瘤细胞抗原表达,理论上具有提高免疫调节能力,同时更昔洛韦(GCV)对该疫苗具有杀伤作用,可以控制活疫苗的增殖,防止疫苗细胞在体内持续增殖或种植转移,在此杀伤过程中,可进一步增强肿瘤抗原的释放和抗原提呈作用,进而达到持续提高胶质瘤的免疫原性,克服因血脑屏障带来的免疫逃避,强化诱导特异性免疫反应。关于本课题提出的可控制性胶质瘤疫苗模式,目前在国内尚未见类似报告。本研究通过对现有9L-rIL12-TK细胞体外纯化抗性筛选,观察其增殖情况,同时对其进行GCV杀伤实验,验证HSV-TK/GCV系统的体外杀伤效应,在此基础上进行裸鼠皮下细胞接种,观察疫苗细胞的体内成瘤情况并对其进行GCV干预,对比干预前后活疫苗细胞成瘤变化,评估9L-rIL12-TK脑胶质瘤基因免疫活细胞疫苗在体内的安全可控性,为后续免疫研究打下基础。材料与方法1实验材料自主构建基因修饰细胞(9L-rIL12-TK、9L-TK),9L大鼠脑胶质瘤细胞;高糖型DMEM培养基,胎牛血清FCS,含0.2%(m/V)EDTA的消化胰酶,更昔洛韦GCV,四甲基偶氮唑蓝MTT,二甲基亚砜(DMSO),BSD,G418,台盘蓝,一次性耗材,BABL/C裸鼠(SPF)等。2实验方法2.1体外细胞实验2.1.1细胞增殖观察抗性筛选细胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L细胞24孔板培养,每日消化一组,计数细胞,连续5天,观察细胞增值稳定性;2.1.2细胞GCV杀伤实验抗性筛选细胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L细胞96孔板培养,次日更换0、5、10、20、40、80、160μg/ml完全培养基培养,每日观察细胞生长情况,第4天MTT法测细胞活力;2.2体内细胞成瘤抑制实验2.2.1裸鼠成瘤实验40只裸鼠随机分为3组,9L-rIL12-TK、9L-TK及9L组,相应细胞右侧腋下接种,1.2×10~6/只;2.2.2成瘤干预实验第7天三组裸鼠每组二次分GEV实验组及生理盐水对照组,次日开始干预,实验组腹腔给予GEV抑瘤干预,对照组给予生理盐水以行对照;2.2.3观察途径定时测量瘤径,记录裸鼠生存时间,实验终止时取相应标本组织学检查。实验结果1.1 24孔板培养观察到抗性克隆细胞呈对数稳定增殖,细胞的种类与各时间点的交互效应有显著性差异(F=4.220,P=00003),不同细胞生长差异有显著性意义(F=8.761,P=0.017),不同时间点细胞有显著性差异(F=2316.347,P=0.000),其中第4天各细胞有显著差异(P=0.005),其余时间点各细胞间无显著差异(P＞0.05);1.2通过含不同浓度的GCV的完全培养基96孔板细胞培养,MTT法检测细胞活力,可见含带TK基因的细胞活力与GCV的浓度呈负相关,不同浓度GCV与三种细胞活力的交互作用有显著性差异(F=407.699,P=0.000),不同浓度的GCV对细胞活力的影响有显著性差异(F=2830.488,P=0.000),三种细胞对GCV敏感性有显著性差异(F=6807.262,P=0.000),其中,在GCV浓度为10ug/ml时,9L-rIL12-TK及9L-TK细胞杀伤率分别为62.7%、50.93%,前者较后者敏感,差异显著(P=0.000),而9L细胞基本不受影响,在浓度20～160ug/ml时,9L细胞和9L-TK、9L-rIL12-TK细胞间有显著差异(均P=0.000),而9L-rIL12-TK细胞和9L-TK细胞间无显著性差异(均P＞0.05),细胞基本完全被杀死,9L细胞仅有少量死亡;2.1疫苗细胞体内成瘤抑制实验9L-rIL12-TK疫苗细胞与9L-TK细胞、9L细胞接种裸鼠皮下,观察到所有裸鼠在第7天均有成瘤,成瘤率100%,GCV干预后,9L-rIL12-TK、9L-TK实验组裸鼠瘤体积均缩小,其余组瘤体继续呈增大趋势。取干预前后及实验后期共四个时间点比较瘤体变化,不同时间点与不同组间裸鼠肿瘤体积增长的交互作用有显著性差异(F=47.004,P=0.000),不同时间点肿瘤体积增长有显著性差异(F=316.600,P=0.000),不同组间裸鼠肿瘤体积增长有显著性差异(F=60.442,P=0.000),其中干预开始即第9天不同组间肿瘤体积(200.025±38.46mm~3)无显著性差异(P=0.476),干预结束后即第18(273.61±256.47mm~3)、27(1078.21±1287.79mm~3)、36(4350.16±4289.69mm~3)天时,9L-rIL12-TK+GCV组和9L-rIL12-TK组比较差异均显著(P=0.003、0.002、0.001),9L-TK+GCV组与9L-TK组差异也均显著(P=0.004、0.001、0.006),9L实验组和对照组比较差异不显著(P＞0.05),干预后不同时间点9L-rIL12-TK+GCV组和9L-TK+GCV组间无显著性差异(P＞0.05),裸鼠瘤体呈消退趋势,其9L-rIL12-TK+GCV组治疗后细胞生长受控(抑瘤率97.26%)较9L-TK+GCV组(抑瘤率82.52%)明显,而9L组与9L+GCV组则无显著差异(P＞0.05),瘤体随时间呈增大趋势。60天时,肿瘤完全消退9L-rIL12-TK+GCV组有8只,复发率为0%,9L-TK+GCV组有3只肿瘤完全消退,5只缩小后再次增大,复发率62.5%。荷瘤裸鼠生存时间均受影响,9L+GCV组与9L组间无显著性差异(LogRankX~2=0.392,P=0.531),而9L-rIL12-TK、9L-TK实验组与相应对照组间均有显著差异(LogRankX~2=15.782,LogRankX~2=15.665,均P=0.000),裸鼠肿瘤消退或生长减慢,动物生存时间延长,尤其9L-rIL12-TK实验组裸鼠完全无瘤生存。2.2裸鼠无瘤接种部位、瘤体及全身相关脏器取材,大体观察,含带rIL-12基因细胞的裸鼠脾脏显著增大,9L-TK实验组后期瘤结节中有大量液化坏死;组织学(苏木精-伊红染色HE)镜下检查,无瘤接种部位无发现异性肿瘤细胞,瘤体中异型性细胞明显,不含带rIL-12基因的细胞瘤结节中血管丰富,而带rIL-12基因的裸鼠脾脏淋巴细胞增多;所有裸鼠全身脏器病理学检查均未见肿瘤远处组织学转移征象。实验结论(1)基因修饰后的9L-rIL12-TK细胞体外增殖稳定,对GCV杀伤效应敏感,表明TK基因在疫苗细胞内是稳定表达;(2) 9L-rIL12-TK细胞在裸鼠体内可成瘤,但能够被GCV抑制消除;(3) 9L-rIL12-TK细胞与9L-TK细胞均在裸鼠体内成瘤,但GCV的抑瘤效果9L-rIL12-TK实验组明显优于9L-TK实验组,表明rIL-12参与调节,从而提高消瘤效果;(4) 9L-rIL12-TK组裸鼠脾脏显著增大,组织学检查淋巴细胞增多,提示rIL-12可能参与调节体液免疫,其机理有待进一步实验研究;(5) 9L-rIL12-TK细胞仅在局部成瘤,未见远处转移征象。上述结论表明,9L-rIL12-TK细胞疫苗在体内外具有较好的增殖活性及安全可控性,其免疫治疗效果尚待进一步实验研究。