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银杏酸(Ginkgolic Acids,GAs)是6烷基或6烯基水杨酸的衍生物,六位上的侧链碳原子数可从13至17,侧链双键数可为0至2个。银杏酸存在于银杏叶、外种皮和种仁中,在银杏的外种皮内分布最广泛。现研究发现的银杏酸主要分为5种:银杏酸C13:0,银杏酸C15:1,银杏酸C17:2,银杏酸C15:0,银杏酸C17:1。银杏酸具有致敏性、胚胎毒性、免疫毒性和细胞毒性等多种生物毒性,被看作是银杏叶提取物中的有害成分。但目前很多研究发现,银杏酸具有多种药理活性,如抗肿瘤、抗菌、杀虫(或其宿主)、抗炎等,应用前景十分广泛。我国银杏资源丰富,据统计每年约有10万吨左右的银杏外种皮被当作废物丢弃,既污染了环境又浪费了大量资源。研究银杏酸的生物活性,可以为银杏外种皮的进一步开发利用奠定理论基础,增加银杏外种皮的利用率,变废为宝,不仅能够带来巨大的经济效益,也能为我国社会环境做出杰出贡献。本研究在已有文献的基础上对银杏酸的提取方法进行了改进,方法简单易行,避免了使用环己烷、氯仿等毒性较强的有机溶剂,适用于银杏外种皮中银杏总酸的提取。从银杏外种皮提取分离得到银杏总酸,再进一步纯化得到五个银杏酸单体化合物,对这五个单体化合物进行了结构鉴定,用于后期生物活性的研究。本研究的实验内容如下:1.银杏酸单体化合物的分离与结构鉴定目的:从银杏外种皮中制备分离银杏酸单体化合物方法:银杏外种皮干燥粉碎后用无水乙醇回流提取得到浸膏,所得浸膏混悬于蒸馏水中,再用等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取,分别萃取两次,合并萃取液减压蒸干,得到石油醚层和乙酸乙酯层提取物。使用薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)点板并展开,在254nm的紫外检测波长下观察到色谱行为相似,合并石油醚层和乙酸乙酯层提取物,进行开放硅胶柱色谱分离,以石油醚,石油醚-乙酸乙酯(9:1,8:2,7:3,1:1;含1%冰醋酸)进行梯度洗脱,最后甲醇冲柱子,共得到21个洗脱组分,点板并展开,在254nm的紫外检测波长下观察,合并蓝紫色斑点的洗脱组分,减压蒸干得到银杏总酸。经半制备型反相高效液相色谱(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)反复纯化,得到银杏酸的五个单体化合物,分别为Fr.A-1-1-1(35 mg),Fr.A-2-2-2(68 mg),Fr.A-3-3(15mg),Fr.B-1-1(20mg),Fr.B-2-2-2(17.5mg)。结果:采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(High performance liquid chromatography-diode array detector,HPLC-DAD)对分离得到的五个银杏酸单体化合物进行纯度分析,每个银杏酸单体化合物的纯度均达95%以上,并通过核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance spectra,1H-NMR)、核磁共振碳谱(13C nuclear magnetic resonance spectra,13C-NMR)和高分辨质谱(High resolution mass spectrometry,HR-MS),鉴定 Fr.A-1-1-1为银杏酸C13:0,Fr.A-2-2-2为银杏酸C15:1,Fr.A-3-3为银杏酸C17:2,Fr.B-1-1为银杏酸C15:0,Fr.B-2-2-2 为银杏酸 C17:1。2.银杏酸单体化合物对黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)的体外抑制活性研究目的:评价银杏酸单体化合物对黄嘌呤氧化酶的体外抑制作用方法:在酶抑制反应中,反应体系中的产物尿酸为XOD的指示剂,在XOD超氧阴离子的生成体系中,加入WST-1检测超氧阴离子生成量。使用微孔板法,评价它们对黄嘌呤氧化酶的体外抑制作用。反应体系中,反应终体积200 μL,黄嘌呤氧化酶溶液终浓度为4 mU/mL,黄嘌呤溶液终浓度为250μmol/L,WST-1溶液终浓度为100μμmol/L。每个供试品设五个浓度,每个浓度平行四个复孔,实验重复三次。使用酶标仪分别在295 nm和450 nm波长下测定每孔的吸光度,计算平均抑制率,并用GraphPad Prism 5.0软件计算半数抑制浓度(Median inhibitory concentration,IC50)。结果:在酶抑制实验中发现,银杏酸C13:0和银杏酸C15:1对黄嘌呤氧化酶的IC50值分别为31.87±1.87和25.48±0.66 μmol/L(n=3,x±s),显示出较好的体外抑制XOD活性;在超氧阴离子清除实验中发现银杏酸C13:0和银杏酸C15:1的IC50值分别为27.39±1.65和17.63±1.36 μμmol/L(n=3,x±s)。比较银杏酸C13:0和银杏酸C15:1对XOD体外抑制和对超氧阴离子清除实验的IC50值,发现后者的IC50值小于前者,说明银杏酸C13:0和银杏酸C15:1不仅对XOD具有抑制作用,而且对超氧阴离子有一定的清除作用。以上结果可为进一步研究银杏酸的抗氧化作用机制以及评价银杏酸对痛风和氧化应激损伤的干预作用提供一定的依据。3.银杏酸单体化合物对PC12细胞的细胞毒实验目的:研究银杏酸单体化合物对PC12细胞的毒性方法:取对数生长期的PC12细胞制成细胞悬液接种于96孔板中,采用MTT 比色法检测细胞活力。每个供试品设五个浓度,每个浓度平行五个复孔,实验重复三次。使用酶标仪在490 nm下测定吸光度,计算平均细胞增殖抑制率,并用GraphPad Prism 5.0软件计算 IC50。结果:银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:2、银杏酸C15:0、银杏酸C17:1的半数抑制浓度分别为 9.42±1.08、10.82±0.80、7.55±0.34、5.85±0.92、5.54±0.47μmol/L(n=3,x±s),各银杏酸单体化合物对PC12细胞生长的抑制作用为:银杏酸C17:1>银杏酸C15:0>银杏酸C17:2>银杏酸C13:0>银杏酸C15:1。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株,具有神经内分泌细胞的一般特征。对PC12细胞的抑制作用可以初步说明银杏酸单体化合物具有一定的神经细胞毒性。综上,本研究对已有的银杏酸提取方法进行了改进,分离得到五个高纯度的银杏酸单体化合物。进一步的生物活性研究发现银杏酸具有一定的黄嘌呤氧化酶体外抑制作用和超氧阴离子清除作用,但是,又表现出一定的神经细胞毒性。因此,研究结果为银杏酸的开发和应用提供一定的理论依据。