EMT (epithelial-mesenchymal-transition)是指细胞自身分子重构导致细胞表型改变的过程,在这个过程中细胞由单极性不能游动的上皮细胞转变为可移动的间质细胞。EMT在组织重构、胚胎发育、肿瘤的侵袭及转移中发挥重要作用。自噬(Autophagy),也称为第二型细胞程序性死亡,是指细胞将自身胞质内物质运送到溶酶体降解、再利用的生物过程。最近的很多研究提示自噬与EMT在多种上皮肿瘤中有密切的联系,自噬在肿瘤由良性向恶性转变的过程中及肿瘤转移的起始阶段可能发挥重要作用。然而,目前关于自噬对胶质瘤侵袭及EMT过程的具体机制仍未有报道。胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,占所有颅内肿瘤的40%,具有高复发率,高致残率和高死亡率,其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤预后中位生存期不超过14个月。虽然目前胶质瘤的治疗方法包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗均取得了丰富的研究成果,但对其预后改善极为有限。胶质母细胞瘤(GBM)预后差的原因有以下两点第一：肿瘤细胞对放化疗的抵抗。第二：单个的肿瘤细胞具有向周围脑实质侵袭的能力,几乎所有患者,手术都不可能完全彻底的切除肿瘤。因此,寻找胶质瘤迁移、侵袭的关键分子靶点,阻断胶质瘤细胞恶性生物学行为成为目前研究者广为关注的重点。miRNAs在肿瘤发生发展中的功能自本世纪初报道以来,迅速成为该研究领域新的热点,并被寄希望于成为肿瘤治疗的重要分子靶点。本课题组在之前的研究中对45例幕上原始神经外胚层肿瘤(sPNET)的基因组进行检测,发现11例标本在19q13.41位点存在DNA高拷贝,并在DNA高拷贝区域中发现了编码49个miRNA的miRNA簇-C19MC (the chr19q13.41microRNA cluster)。随后的基因表达谱分析发现在伴有C19MC高拷贝的标本中,细胞自我更新及细胞存活相关基因的高表达。在这些miRNA中,miR-512-3p,517a,517c,519a及520g在具有C19MC高拷贝的sPNET标本中的表达量明显增高。随后在两种神经干细胞、部位不同的胎脑及成人脑组织中检测了这些miRNAs的表达情况,结果提示miR-517c及miR-519a在脑组织的胚胎发育过程中可能发挥重要作用。通过实时定量PCR (RT-PCR)技术对6个胶质瘤细胞系进行检测,结果表明miR-517c及miR-519a在GBM细胞中的表达量要高于胎脑,提示我们miR-517c及miR-519a在GBM细胞中可能存在一定的生物学作用。以上的这些研究结果为本研究提供了重要线索。本实验拟进一步探讨自噬对p53表型不同的U87及U251细胞迁移能力的影响；miR-517c在胶质瘤中发挥的生物学作用以及发挥作用的具体分子机制；miR-517c的生物学作用与自噬及EMT的关系；这种关系是否与p53表型不同有关；旨在寻求胶质瘤治疗的新策略。第一章自噬对p53表型不同的U87及U251细胞迁移的影响目的：探讨自噬与胶质瘤细胞迁移的作用以及这种作用是否与细胞的p53表型有关。方法：替莫唑胺(TMZ)及低糖培养作为胶质瘤细胞自噬的诱导条件,3-MA及氯喹作为自噬抑制剂,通过划痕实验(wound healing assay)及Transwell实验检测p53野生型U87细胞及p53突变型U251细胞在自噬诱导及抑制作用下细胞迁移能力的改变。并通过免疫荧光、Western-blot验证细胞在自噬诱导及抑制的情况下自噬标志蛋白LC3B的表达情况。结果：TMZ (150μmol)促进了p53野生型U87细胞形态的改变而对p53突变型U251的形态影响不大,而且TMZ改变U87细胞形态的作用能被自噬抑制剂3-MA及氯喹(CQ)减弱。划痕实验结果显示U87(p53wt)细胞在TMZ的作用下迁移能力增强,而自噬抑制剂3-MA及氯喹能减弱TMZ的促迁移作用。U251细胞中TMZ对细胞的迁移能力作用不明显,甚至将TMZ作用浓度提高到300μmol时,U251的迁移能力仍未改变。Transwell实验表明U87细胞在TMZ作用下迁移能力增强(F=12.890, P=0.002), TMZ组与正常培养、TMZ+3-MA、TMZ+CQ各组间差异具有统计学意义,P值分别为0.002、0.007、<0.001。Western-blot及免疫荧光结果提示在TMZ作用下U87细胞的自噬标志蛋白LC3B的表达量增加,而且代表自噬活动强弱的LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显增高。在U251细胞中,TMZ (150μmol)作用下细胞自噬水平改变不明显。此外低糖培养条件诱导的自噬也促进U87细胞的迁移,同样该作用能被自噬抑制剂3-MA及氯喹抑制(F=25.629,P=0.001),低糖组与正常培养、3-MA+LG、CQ+LG组差异具有统计学意义,P值分别为0.017,<0.001,<0.001；而在U251中低糖培养对细胞迁移能力改变不明显。结论：TMZ (150μmol)及低糖培养通过诱导自噬促进了p53野生型U87细胞的迁移。在p53突变型的U251细胞中,TMZ (150μmol)及低糖培养不能诱导自噬,对细胞迁移能力作用不明显。提示自噬与胶质瘤细胞的迁移有密切关系,在p53表型不同的胶质瘤细胞中,这种关系存在差异。第二章第一节体外实验中miR-517c抑制了U87细胞的迁移、自噬及EMT而在U251细胞中不具备这些功能目的：体外实验探讨miR-517c在p53表型不同的U87及U251细胞中的生物学作用。方法：使用化学合成的miR-517c mimics, Negative control (NC), miR-517c inhibitor (inhibitor)寡核苷酸转染U87细胞后,用CCK-8检测了转染后各组细胞在TMZ作用下细胞活力的变化；用PI-流式细胞仪检测细胞周期,AnnexinV-PI流式细胞仪检测细胞凋亡,Western-blot检测凋亡关键蛋白Caspase-3, Caspase-9。随后用携带miR-517c mimics, NC, inhibitor序列的慢病毒分别感染U87及U251细胞,建立miR-517c, NC, inhibitor稳定表达的U87及U251细胞(U87-miR-517c, U87-NC, U87-inhibitor, U251-miR-517c, U251-NC, U251-inhibitor)。用qRT-PCR对各种细胞内miR-517c的表达情况进行鉴定。随后采用划痕实验及Transwell实验对各种稳定转染细胞的迁移能力进行了分析。Western-blot检测各种稳转细胞中自噬及EMT相关蛋白的表达量。免疫荧光进检测各种稳定转染细胞中自噬蛋白LC3B的表达量。透射电镜检测各种稳定转染细胞中自噬相关小泡的数量。结果：U87细胞分别转染miR-517c、NC、Inhibitor后,组间细胞活力在6h(F=1.019, P=0.416)、24h (F=0.677, P=0.543)、48h (F=0.112, P=0.896)、96h(F=1.717,P=0.257)时的差异无统计学意义；miR-517c, NC, inhibitor各组间细胞周期的差异无统计学意义(F=0.063, P=0.680); AnnexinV-PI流式细胞仪检测细胞凋亡,发现U87细胞在转染miR-517c, NC, inhibitor后TMZ作用下各组间凋亡细胞的百分比差异不明显；Western-blot显示各组间凋亡关键蛋白Caspase-9,6aspase-3及片段化的Caspase-3的表达量在各组间差异不大。稳定表达miR-517c的U87细胞在形态上与NC组及inhibitor组细胞存在差异,而在U251细胞中并未出现这种形态学差异。划痕实验及Transwell实验结果表明无论在正常培养条件下(还是在TMZ(150μmol)作用下,U87-miR-517c细胞的迁移能力要弱于U87-NC及U87-inhibitor,正常培养条件下三组间F值为45.473, P<0.001, miR-517c Vs NC及miR-517c VS Inhibitor组间差异具有统计学意义,P值分别为0.003,<0.001；TMZ作用下三组间F值为36.055,P<0.001, miR-517c Vs NC及miR-517c VS Inhibitor组间差异具有统计学意义,P值分别为0.005,<0.001；而稳转后的三种U251细胞的迁移能力差异不明显。Western-blot结果显示在稳定转染的细胞中miR-517c抑制了U87细胞自噬相关蛋白如,Beclinl, Atg3, Atg5, Atg7, Atg12的表达及LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化,同时抑制了EMT过程中的间质标志物Vimentin, N-cadherin及EMT调节因子ZEB1, Slug, Snail的表达并伴有上皮标志物T-cadherin, Claudin表达的上调,而在U251细胞中miR-517c并未抑制细胞自噬及EMT相关蛋白。免疫荧光结果表明U87细胞的miR-517c组中自噬标志蛋白LC3B的表达要低于NC,及inhibitor组,而在U251细胞中未发现这一改变。透射电镜发现U87-miR-517c细胞中自噬相关小泡的数量小少于U87-NC及U87-inhibitor组,而在U251-miR-517c,U251-NC,U251-inhibitor中自噬小泡的数量差异不明显。结论：体外实验中miR-517c对TMZ作用下U87细胞活力、周期、凋亡影响不大,但是改变了细胞形态,抑制了细胞的迁移,并且抑制了自噬及EMT的发生。在U251细胞转染miR-517c后,细胞的形态、迁移能力、自噬及EMT变化不大。第二章第二节裸鼠皮下移植瘤模型中miR-517c抑制了胶质瘤的侵袭、自噬及EMT目的：体内实验验证miR-517是否同样具有抑制U87细胞迁移、自噬及EMT的作用。方法：为进一步确认miR-517c对U87细胞在体内是否具有同样的作用,我们进行了裸鼠皮下移植瘤试验,10只裸鼠,每5只一批,双侧腹股沟区皮下分别接种5×106个U87-miR-517c(左)和U87-NC(右)细胞,或者5×106个U87-inhi-bitor(左)和U87-NC(右)细胞,每4天观测各组细胞在体内成瘤情况。24天后处死裸鼠,通过活体成像系统(KODAKO2000)记录裸鼠成瘤情况,然后仔细的解剖分离肿瘤,观察肿瘤与周围组织的侵袭、粘连的情况并拍照记录；测量并计算肿瘤体积大小。对肿瘤组织切片(荧光拍照)进行H&E染色。免疫组化检测肿瘤中EMT相关蛋白的表达量及细胞定位。透射电镜检测各组肿瘤中自噬相关小泡的数量。结果：全部10只裸鼠皮下移植瘤形成。miR-517c组(5只)肿瘤体积大于NC组(5只),但是无统计学差异(F=2.155, P=0.216):Inhibitor组(5只)肿瘤体积大于Inhibitor NC组(5只),且差异具有统计学意义(F=36.685,P=0.004)。miR-517c组细胞对周围组织的侵袭力弱于NC组及inhibitor组,组织切片H&E染色及荧光图片均显示U87-miR-517c组肿瘤对周围结缔组织及肌肉组织的侵袭性要弱于NC组及inhibitor组。免疫组化发现miR-517c抑制了EMT过程中的间质标志物Vimentin,N-cadherin及EMT调节因子ZEB1,Slug, Snail的表达并伴有上皮标志物T-cadherin, Claudin表达的上调,说明miR-517c抑制了EMT的发生。肿瘤组织透射电镜结果提示miR-517c抑制了自噬的发生,因为在miR-517c组肿瘤中自噬相关小泡的数量少于NC组及inhibitor组。结论：体内实验同样证明miR-517c抑制了U87细胞的迁移,减弱了肿瘤对周围结缔组织及肌肉组织的浸润,同时miR-517c抑制了自噬及EMT的发生。第三章第一节KPNA2是miR-517c的靶基因并通过干扰p53核质转运发挥作用目的：通过双向蛋白电泳及质谱分析结合生物信息学检索初步确定miR-517c的靶基因,并通过生物学实验来验证靶基因；探讨靶基因发挥作用的机制；方法：对分别转染了miR-517c mimics及NC的U87细胞进行双向蛋白电泳分析差异点并进行质谱分析寻找差异蛋白,然后结合生物信息学分析我们初步确定miR-517c的靶基因。Western-blot验证U87及U251细胞中miR-517c下调了靶基因的蛋白水平。构建了携带与miR-517c结合的KPNA2-3’-UTR区的荧光素酶报告基因载体pGL3-KPNA2-UTR以及携带突变型KPNA2-3’-UTR的基因载体pGL3-KPNA2-3’-UTR-mutant,采用RT-PCR验证了各种质粒降低miR-517c的能力；荧光素酶报告系统检测靶基因KPNA2-3’UTR区荧光素酶活性；免疫荧光-共聚焦观察U87及U251细胞在转染miR-517c, NC, inhibitor后细胞中p53蛋白的分布情况。结果：双向蛋白电泳发现U87-517c及U87-NC组间存在一个明显的差异蛋白点,通过质谱分析,显示这一差异蛋白点是KPNA2。生物信息学检索(TargetScan及microrna)虽然未找到KPNA2是miR-517c靶点的证据,但是通过对比miR-519a与miR-517c碱基序列,发现只有2个核苷酸差异,而KPNA2恰巧是miR-519a的靶基因,我们推测KPNA2可能是miR-517c的靶基因。将报告质粒与miR-517c mimics, mimics NC, inhibitor, inhibitor NC共转染至U87细胞中,检测荧光素酶的活性,结果发现,在含有野生型KPNA2-3’-UTR (pGL3-KPNA2-3’UTR)的质粒时,miR-517c明显抑制荧光素酶的活性,相反inhibitor明显增加了荧光素酶的活性(F=61.113, P<0.001;miR-517cVS mimicsNC及InhibitorVS InhibitorNC的P值均小于0.001)；在pGLV-3及pGL3-KPNA2-3’UTR-mutant质粒中总体F值分别为0.074及0.653,P值分别为0.973及0.590。表明KPNA2是miR-517c作用的直接靶基因。免疫荧光共聚焦结果发现,与NC及inhibitor组相比,U87-miR-517c细胞中更多的p53蛋白分布在细胞质中,而在U251细胞中各组间p53蛋白在胞质及胞核中的分布差异不大。结论：KPNA2是miR-517c的靶基因,miR-517c干扰了U87细胞中p53蛋白的核质转运过程。提示miR-517c是通过KPNA2干扰p53蛋白的核质转运而发挥抑制自噬及EMT的作用。第三章第二节miR-517c的作用是通过KPNA2实现的并且是p53依赖的目的：探讨KPNA2的表达量与自噬的关系；探讨miR-517c的作用是否依赖于p53。方法：通过pCDNA-KPNA2及pSilencer-KPNA2-shRNA在U87及U251细胞中分别构建了KPNA2过表达(overexpress)及KPNA2低表达的细胞(knockdown)。用Western-blot及免疫荧光验证新构建细胞(U87-KPNA2oe, U87-KPNA2shRNA, U87-NC, U251-KPNA2oe, U251-KPNA2-shRNA, U251-NC)的自噬情况。通过psilencer-p53-shRNA质粒干扰掉U87细胞中的p53蛋白,然后再验证miR-517c是否还具有抑制自噬的能力。在p53+／+及p53-／-的HCT116结直肠癌细胞中验证miR-517c的功能。结果：Western-blot及免疫荧光验证了新构建的细胞(U87-KPNA2oe及U87-KPNA2shRNA)的自噬情况,结果表明U87-KPNA2oe细胞中自噬相关蛋白的表达量要高于U87-KPNA2shRNA及U87-NC组,而U251-KPNA2oe及U251-KPNA2shRNA及U251-NC组中自噬相关蛋白表达量无明显差异。Western-blot显示当U87细胞的p53干扰掉后,miR-517c不再下调自噬相关蛋白的表达。Western-blot结果显示在p53+/+HCT116细胞中,miR-517c下调KPNA2及了自噬相关蛋白Beclin1, Atg3, Atg5, Atg7, Atg12的表达及LC3BⅡ向LC3BⅠ的转化,而在p53-/-HCT116细胞中,尽管miR-517c下调KPNA2的表达但自噬相关蛋白的表达量无明显变化。结论：U87细胞中KPNA2的表达量与自噬相关蛋白的表达量正相关,而在U251细胞中不存在这一改变。miR-517c抑制自噬的作用是通过KPNA2实现的,并且是p53依赖的。miR-517c/KPNA2/p53通路在调节胶质瘤细胞自噬及EMT过程中发挥重要作用。第四章miR-517c在6BM中的表达与患者的预后有关目的：探讨miR-517c与GBM患者预后的关系方法：用qRT-PCR检测46例GBM患者肿瘤中miR-517c的表达情况,并通过电话及写信的方式对患者进行随访,通过Kaplan-Meier分析患者的预后与miR-517c表达量的关系。结果：在17例患者中(36.9%), miR-517c的表达量高于平均值,我们将其归为miR-517c高表达组(miR-517c(+)),另外29例患者的miR-517c的表达量低于平均值,我们归为miR-517c低表达组(miR-517c(-))。通过Kaplan-Meier分析患者的预后,结果表明miR-517c高表达组患者的无肿瘤存活率要高于miR-517c低表达组(x2=1.403,P=0.001),而且miR-517c高表达组患者的总体生存率都要高于miR-517c低表达组(x z=6.619,P=0.010)。结论；GBM患者中,miR-517c低表达的患者预后更差,而miR-517c高表达的患者预后更好,提示miR-517c可能是胶质瘤治疗中一个新的分子靶点。