论文部分内容阅读
反向筛选标记指在一定的筛选条件下,含有标记基因的菌株死亡,不含有筛选标记基因的菌株反而能存活下来的标记基因。这样一来,既不引入抗性基因,又能到达筛选的目的。upp基因广泛存在于原核生物和某些低等真核生物细胞中,其表达产物为尿嘧啶磷酸核糖转移酶(Uracil Phosphoribosyltransferase,UPRT)。UPRT能将5-氟尿嘧啶转化成5-氟单磷酸脱氧尿嘧啶,从而抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性,导致细胞死亡。利用这一特性,upp基因可用来作为反向筛选筛标记基因。本研究主要利用Red同源重组系统敲除大肠杆菌DH5α的upp基因,构建得到重组菌DH5α-△upp。该重组菌可作为反向筛选标记基因upp使用的宿主菌。敲除方案有两种：一种是运用PCR技术,扩增出两翼与upp基因上下游同源臂同源,中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段。同源臂长度为50bp。经电转化,将外源DNA片段转入含有质粒pKD46的大肠杆菌DH5a中。在Red重组酶的作用下,外援DNA片段与染色体上的同源区域发生重组,将upp基因置换,得到upp基因敲除缺陷菌株DH5α-△upp。另一种方法是用PCR的方法合成upp基因上游和下游的两个同源臂序列,分别为853bp和804bp。再以上下游同源臂为模板重叠延伸合成线性DNA片段。将该片段电转入含有质粒pKD46的大肠杆菌DH5a,双交换得到重组子。重组子的筛选利用upp基因作反向筛选。与野生型相比,upp基因敲除的突变株生长速度略有变慢,但是对5-氟尿嘧啶的抗性显著提高。用DH5α-△upp作为宿主菌,upp基因作负筛标记,构建非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶的筛选系统,并用iodoPheRS做试验,证实该系统的可行性,为筛选其他非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶奠定了基础。