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背景和目的血管重建术后内膜增生引发的再狭窄一直是临床的热点和难点问题。而血管内膜损伤是导致后续一系列级联反应(血小板及炎性细胞粘附活化、平滑肌细胞增殖迁移),并最终引发再狭窄的首要环节。而多种损伤因子(手术、高血糖、高血脂、吸烟、缺血-再灌注等)均可通过氧化应激反应引发血管内皮细胞凋亡进而造成内膜损伤。因此,抑制氧化应激导致的血管内皮细胞凋亡,增强对血管内膜的保护作用可能成为减轻损伤后内膜增生的新方法。以往研究中多采用抗氧化药物以减轻氧化应激介导的细胞凋亡,但系统性给药难免使损伤局部血药浓度过低,达不到真正意义上的抗氧化效应。随着基因治疗技术的发展,血管局部定位基因转染逐步成为防治再狭窄研究的热点,可将特定基因精确转染至血管壁,最大程度的在局部发挥作用。本研究在体外脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化损伤模型的基础上,利用重组腺病毒载体预先将抗凋亡基因Bcl-xl导入内皮细胞,研究Bcl-xl过表达可否抑制氧化应激导致的内皮细胞凋亡以及对内皮细胞功能的保护作用,进而为促进受损内皮细胞的快速修复、防止术后管腔再狭窄的基因治疗提供实验依据。内容和方法1、重组腺病毒基因载体的构建(1)提取目的基因Bcl-xl及构建质粒载体pGEM-T-Bcl-xl;(2)以上述质粒载体为模板构建重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-Bcl-xl,司时构建空病毒载体pAdxsi-GFP作为对照；(3)以不同感染复数(MOI)的重组腺病毒感染HUVEC,评估感染率,通过Western Blot检测感染后HUVEC中目的蛋白Bcl-xl的表达情况。2、Bcl-xl过表达的HUVEC抗氧化凋亡能力及内皮细胞相关功能检测(1)H2O2诱导HUVEC凋亡模型的建立;(2)实验细胞分组：正常HUVEC组(Normal组)、正常HUVEC+H2O2组(H202组)、经pAdxsi-GFP-Bcl-xl转染的HUVEC+H2O2组(Adv-GFP-Bcl-xl组)、经pAdxsi-GFP转染的HUVEC+H2O2组(Adv-GFP组);(3) Bcl-xl过表达的HUVEC抗氧化凋亡能力检测通过倒置显微镜观察、Hoechst33258细胞核染色,了解各组在氧化应激刺激下细胞形态学改变的差异通过PI染色／流式细胞仪进行细胞周期检测,得出G0／G1期细胞比例,进而评估凋亡率通过Western Blot进行凋亡相关蛋白(Caspase-7, PARP)检测(4)探索Bcl-xl过表达可否保护氧化应激条件下内皮细胞的正常功能通过CCK-8检测及细胞免疫组化染色了解细胞增殖能力通过细胞划痕试验了解各组在氧化损伤后的迁移能力上有无差异通过Real-time PCR检测氧化损伤后各组细胞内eNOS在mRNA水平上的表达差异通过ELISA检测各时间点(0h、24h、36h、48h)每组细胞培养上清中VEGF的分泌量研究路线图结果1、重组腺病毒成功感染HUVEC,最适MOI为100。Western Blot结果显示目的蛋白Bcl-xl高表达于病毒感染后的HUVEC。2、Bcl-xl过表达增强HUVEC耐受氧化损伤的能力,同时保护了内皮细胞功能(1)成功建立H2O2诱导HUVEC凋亡模型,凋亡率与H2O2浓度具有量效关系；(2)正常HUVEC在氧化应激条件下细胞形态发生改变,同时染色体固缩。而Bcl-xl过表达的HUVEC在形态上无明显改变,固缩核细胞比例明显降低；(3) Bcl-xl过表达后的HUVEC,处于G0／G1期的细胞比例明显降低；(4) Western Blot检测凋亡相关蛋白结果显示：H2O2组及Adv-GFP组细胞在氧化应激下,细胞内可检测到Cleaved caspase-7及Cleaved PARP表达,而Adv-GFP-Bcl-xl组上述蛋白表达量明显降低；(5)在细胞增殖方面,H2O2组及Adv-GFP组细胞在氧化应激条件下,细胞倍增速度明显下降。而Adv-GFP-Bcl-xl组细胞的生长曲线与正常组细胞基本一致。同时Adv-GFP-Bcl-xl组PCNA阳性细胞比例有所升高；(6)细胞划痕试验结果显示Adv-GFP-Bcl-xl组划痕愈合较H2O2组及Adv-GFP组明显加快,与正常组细胞愈合能力基本一致；(7) Real-time PCR结果显示氧化应激刺激后,Adv-GFP-Bcl-xl组较H2O2组及Adv-GFP组细胞内eNOS mRNA表达量明显上调；(8) ELISA结果显示H2O2处理的三组细胞较正常组细胞VEGF分泌量明显升高,同时Adv-GFP-Bcl-xl组VEGF分泌量高于H2O2组及Adv-GFP组。结论1、重组腺病毒对HUVEC具有较高的感染效率,最适MOI为100；2、通过细胞形态学、细胞周期及Western Blot凋亡相关蛋白检测,结果表明Bcl-xl过表达可明确抑制氧化应激诱导的内皮细胞凋亡；3、通过Real-time PCR、ELISA、细胞划痕试验等方法行内皮细胞功能相关检测,结果表明Bcl-xl过表达在氧化应激条件下可以保护内皮细胞的增殖、迁移、合成及分泌等功能。