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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的主要致病菌之一,可引起仔猪黄痢、白痢和水肿病等多种疾病,造成仔猪生长发育迟缓,饲料利用率下降,使生猪养殖业遭受严重经济损失。仔猪感染ETEC后,会引起肠道上皮细胞受损,以及严重肠道炎性反应,引起一系列临床症状,如腹泻、尿道炎、乳房炎、脑炎和败血症等,严重者可导致仔猪死亡。目前,常选用抗生素治疗仔猪肠道ETEC感染,由于ETEC易产生耐药性及血清型较多的特点,且疫苗接种预防效果亦不理想。在防治仔猪ETEC性肠道疾病时,常采用中药复方进行防治,甘草是组方中常用的中药之一。有研究表明,甘草多糖是甘草的主要药效成分之一,具有增强免疫、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等功效。因此,为了探讨ETEC感染对猪肠道上皮细胞免疫机能影响及甘草多糖的调控作用,本文开展了以下研究:1.通过CCK-8法测定不同浓度ETEC感染猪肠道上皮细胞的细胞活力。结果表明:1×10~8 CFU/mL ETEC作用2h时抑制细胞增殖作用最为明显(P<0.05);以浓度为1×10~8 CFU/mL的ETEC分别感染猪肠道上皮细胞15、30、45、60、75、90、105、120min后,采用real-time PCR法检测肠道上皮细胞中TLR2、TLR4、TLR9、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-αmRNA表达量。结果表明:浓度为1×10~8 CFU/mL的ETEC感染猪肠道上皮细胞于不同时间段后,TLR2 mRNA表达量在60、90、105min时显著高于对照组(P<0.05);TLR4和IL-4 mRNA表达量均在105min时显著高于对照组(P<0.05);TLR9 mRNA表达量在75、105min时均显著高于对照组(P<0.05),其余时间段均显著低于对照组(P<0.05);IL-1βmRNA表达量在15、30、45min时显著高于对照组(P<0.05);IL-6 mRNA表达量在15、30min时显著低于对照组(P<0.05),但在90、105min时显著高于对照组(P<0.05);IL-8和TNF-αmRNA表达量均在45min-120min时显著高于对照组(P<0.05);IL-10 mRNA表达量在15min-105min时均显著高于对照组(P<0.05)。即ETEC感染可引起猪肠道上皮细胞促炎性及抗炎性细胞因子表达紊乱,引起炎性损伤。2.通过不同浓度的甘草多糖(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL)与猪肠道上皮细胞共培养48h后,CCK-8法检测猪肠道上皮细胞的细胞活力。结果表明:3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL的甘草多糖对猪肠道上皮细胞的细胞活力无显著影响(P>0.05),即对猪肠道上皮细胞无细胞毒性作用。同时,浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL的甘草多糖与猪肠道上皮细胞共培养48h后,按照MOI指数为1:100的ETEC感染细胞2h后,CCK-8法检测仔猪肠上皮细胞的细胞活力。结果表明:3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL的甘草多糖均可有效维持ETEC感染猪肠道上皮细胞的细胞活力正常。3.不同浓度甘草多糖(3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)与猪肠道上皮细胞共培养48h后,按MOI指数为1:100的ETEC对猪肠道上皮细胞感染15、30、45、60、75、90、105、120min后,采用real-time PCR法检测肠道上皮细胞中TLR2、TLR4、TLR9、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达量。结果表明:甘草多糖与猪肠道上皮细胞共培养48h,经ETEC感染105min后,3.125μg/mL-100μg/mL甘草多糖均可降低TLR2受体的表达(P<0.05);6.25μg/mL-100μg/mL的甘草多糖均可降低TLR4受体的表达(P<0.05);12.5μg/mL和25μg/mL的甘草多糖可降低TLR9受体的表达(P<0.05)。经ETEC感染15min后,3.125、25、50、100μg/mL的甘草多糖可抑制ETEC感染细胞IL-1βmRNA的表达升高(P<0.05);12.5-100μg/mL的甘草多糖可抑制ETEC感染细胞IL-6 mRNA的表达升高(P<0.05);经ETEC感染105min后,6.25μg/mL-100μg/mL的甘草多糖可抑制ETEC感染细胞IL-6 mRNA的表达升高(P<0.05);12.5μg/mL-100μg/mL的甘草多糖可抑制ETEC感染细胞IL-8 mRNA的表达升高(P<0.05);50μg/mL和100μg/mL的甘草多糖可抑制ETEC感染细胞TNF-αmRNA的表达升高(P<0.05),减少ETEC诱导的猪肠道上皮细胞的炎性损伤。综上所述,甘草多糖可通过抑制TLR2、TLR4、TLR9受体和促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA的表达,抑制ETEC感染引起的猪肠道上皮细胞的炎性反应,达到保护ETEC感染下的猪肠道细胞免疫机能的正常,具有临床应用前景。