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目的: 动脉粥样硬化是一种以胆固醇在动脉内膜沉积为特征的慢性疾病。巨噬细胞源性泡沫细胞的形成在动脉粥样硬化发生和进展中起到关键作用。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)以ATP为能源,促进细胞内游离胆固醇和磷脂流向贫脂的载脂蛋白 A-1(apolipoprotein A-1, apoA-1),通过增加高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)的形成启动胆固醇逆向转运,进而促进泡沫细胞中胆固醇的外流。apoA-1介导的胆固醇流出途径需要多种细胞蛋白和信号转导的参与,包括腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)/环腺苷一磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信号通路。由于多种 AC亚型在 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中表达,为此本实验拟研究AC亚型之一——AC1在apoA-1介导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出途径中的作用。 方法: 1.用PMA和acLDL处理THP-1细胞,建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型。加入apoA-1作用后,qPCR分析AC1~AC9亚型mRNA的表达变化,Western blotting分析AC1和ABCA1蛋白的表达变化。 2.以AC1基因为靶点,设计shRNA干扰片段,构建pGMLV-SC1 RNAi慢病毒载体,合成shRNA干扰慢病毒,同时设计合成对照NC shRNA慢病毒;感染THP-1细胞(MOI=30),qRT-PCR和Western blotting鉴定干扰效率。 3.液体闪烁计数法检测泡沫细胞、apoA-1处理的泡沫细胞、AC1干扰泡沫细胞及NC泡沫细胞的胆固醇流出率;试剂盒测定不同处理组泡沫细胞内cAMP浓度及细胞内总胆固醇含量。 4.用FilipinⅢ染色胆固醇,激光共聚焦显微镜观察泡沫细胞、apoA-1处理的泡沫细胞、AC1干扰细胞及NC泡沫细胞内胆固醇的变化以及胆固醇和apoA-1的共定位情况。 5.激光共聚焦显微镜观察泡沫细胞、apoA-1处理的泡沫细胞、AC1干扰细胞及NC泡沫细胞内ADFP、β-COP和ABCA1的表达变化。 结果: 1. qRT-PCR分析显示,PMA组、acLDL组和apoA-1处理的泡沫细胞组AC1 mRNA的相对表达量分别为1.004±0.054、2.215±0.085、3.655±0.003。与acLDL组相比, apoA-1处理组 AC1 mRNA表达量明显升高,差异有统计学意义(P=0.001)。apoA-1处理组AC2~AC9 mRNA相对表达量分别为1.715±0.216、2.009±0.108、1.625±0.064、0.535±0.045、1.004±0.054、0.651±0.005、1.095±0.043、1.014±0.010,与acLDL组相比,差异不显著(P>0.05)。故后续研究中选取AC1作为主要研究亚型。Western blotting分析显示,apoA-1处理的泡沫细胞组较acLDL组,AC1蛋白表达量升高38%,ABCA1蛋白表达升高30%,差异均有统计学意义(P<0.05)。 2.与acLDL组相比,qRT-PCR结果显示,干扰组AC1 mRNA相对表达量下降75%(P=0.001);与apoA-1处理组和NC组相比,感染组AC1 mRNA相对表达量下降超过90%,差异有统计学意义(P=0.001)。Western blotting分析显示,与acLDL组相比,干扰组AC1蛋白表达量下降55%;与apoA-1处理组和 NC组相比,干扰组 AC1蛋白表达量下降达64%,差异具具有统计学意义(P<0.001)。结果表明,构建的慢病毒载体具有较好的干扰效果。 3.液体闪烁计数法测得acLDL组、apoA-1组、AC1干扰组及NC组泡沫细胞的胆固醇流出率分别为(2.001±2.216)%、(13.520±0.656)%、(2.572±1.692)%和(14.035±0.019)%。与apoA-1处理组和NC组相比,AC1干扰的泡沫细胞胆固醇流出率降低超过80%,有统计学差异(P=0.001)。试剂盒测定acLDL组、apoA-1组、AC1干扰组及NC组泡沫细胞内cAMP浓度分别为(1.722±0.013)pmol/mg蛋白、(2.715±0.031)pmol/mg蛋白、(1.602±0.022)pmol/mg蛋白、(2.729±0.008)pmol/mg蛋白。与apoA-1处理组和NC组相比,AC1干扰的泡沫细胞内cAMP浓度降低达40%,差异有统计学意义(P=0.001)。acLDL组、apoA-1组、AC1干扰组、NC组细胞内的总胆固醇含量分别为(69.798±4.337) nmol/mg蛋白、(50.310±4.477)nmol/mg蛋白、(80.763±5.445)nmol/mg蛋白、(55.391±4.385)nmol/mg蛋白。与apoA-1处理组和NC组相比,AC1干扰的泡沫细胞内总胆固醇含量明显升高,差异有统计学意义(P=0.01)。 4.激光共聚焦显微镜观察,acLDL处理的泡沫细胞内,胆固醇含量明显增强,FilipinⅢ染色出现很强的蓝色荧光;apoA-1处理泡沫细胞后,胆固醇流出增强,故apoA-1组和NC组泡沫细胞内蓝色荧光明显减弱,同时apoA-1红色荧光多集中在靠近细胞膜的位置,且膜表面有被红色荧光包裹的突起分泌小泡;而AC1干扰细胞的泡沫细胞内,蓝色荧光强度相比 apoA-1组和 NC组增强,且apoA-1红色荧光多出现在无突出小泡的平滑细胞膜部位。观察结果提示,AC1基因干扰后,apoA-1介导的泡沫细胞胆固醇囊泡分泌减弱。 5.激光共聚焦显微镜观察到泡沫细胞内有大量ADFP红色荧光蛋白表达,且在整个细胞内点状分布;apoA-1处理的泡沫细胞和NC泡沫细胞内ADFP荧光明显减弱,而AC1干扰的泡沫细胞内ADFP荧光又相对增强。 对β-COP表达的观察显示,THP-1巨噬细胞和 acLDL处理的泡沫细胞内β-COP在细胞质中表达,且呈点状分布;apoA-1处理的泡沫细胞和 NC泡沫细胞内,β-COP的表达则多趋向分布于细胞膜周围;而在AC1干扰的泡沫细胞内,β-COP的分布则多聚集在细胞核周围,表明AC1促进β-COP囊泡从细胞质易位到细胞膜并促进胞吐作用。 激光共聚焦显微镜观察可见,THP-1巨噬细胞内 ABCA1红色荧光较弱;acLDL作用的泡沫细胞内胆固醇的累积使ABCA1表达增强,红色荧光增强,且在细胞内呈点状分布。apoA-1处理的泡沫细胞和NC泡沫细胞内红色荧光更强, ABCA1的表达持续增加,且出现在靠近细胞膜边缘的位置;在AC1干扰的泡沫细胞内,ABCA1红色荧光强度减弱,其分布又多表现为在细胞质中分散点状分布。结果进一步说明,在AC1的作用下产生的cAMP使ABCA1的表达增强,进而促进胆固醇囊泡分泌。 结论: 研究表明,apoA-1介导的巨噬泡沫细胞胆固醇流出途径中,AC1是催化cAMP生成进而促进胆固醇转运和胞吐的主要亚型。