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目的:(1)利用分枝杆菌噬菌体重组系统构建结核分枝杆菌Rv2346c基因敲除株;(2)探索重组蛋白Rv2346c对小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞株)和人单核巨噬细胞(U937细胞株)的免疫功能的影响及其相关机制;(3)分别使用结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)标准株H37Rv、无毒株H37Ra、Rv2346c基因敲除株ΔRv2346c及其回补株ΔRv2346c/ΔRv2346c::p MV261感染小鼠肺组织,观察比较肺组织的病理损伤,探讨结核分枝杆菌Rv2346c基因功能。方法:(1)构建同源交换位点,将其整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组,获得噬菌粒,将噬菌粒导入耻垢分枝杆菌,获得整合有同源交换位点的重组噬菌体,经体外扩增获得高滴度重组噬菌体,对结核分枝杆菌进行转染,将转染后的结核分枝杆菌涂布到潮霉素抗性的固体培养基,37℃培养4周,挑取单克隆,通过PCR方法验证基因敲除是否成功。(2)通过DNA合成、基因扩增、载体构建、诱导表达、纯化等过程制备重组蛋白Rv2346c;采用Cell Counting Kit-8(CCK8)方法检测RAW264.7和U937细胞增殖能力;采用菌落形成试验评估BCG生长情况;运用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法检测BCG和RAW264.7、U937共培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的浓度;Western blot法检测RAW264.7和U937细胞中核转录因子-κB(NF-κB)p65的表达水平。(3)分别用MTB菌株H37Rv、H37Ra、ΔRv2346c、ΔRv2346c/ΔRv2346c::p MV261气管内感染C57BL/6小鼠,在感染35天处死小鼠,获取肺组织,将组织匀浆的系列稀释液涂布在Middlebrook 7H11琼脂上,37℃温育4-6周后计数比较各组细菌CFU,肺组织病理标本则通过HE染色及免疫荧光法比较各组炎性损伤、巨噬细胞组织分布及相关炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平,并在感染56天时,对各组的存活率进行比较分析,综合评判Rv2346c功能。结果:(1)经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,并成功切除靶片段。(2)DNA测序及Western blot检测证实成功制备重组蛋白Rv2346c,重组蛋白Rv2346c蛋白的单独刺激不影响RAW264.7及U937细胞增殖,但可促进BCG对RAW264.7及U937细胞增殖的抑制作用(P<0.05),并抑制RAW264.7对BCG的灭活效应(P<0.05);Rv2346c可以抑制RAW264.7及U937细胞TNF-α和IL-6分泌(P<0.05),并抑制NF-κB p65的表达(P<0.05)。(3)结核杆菌攻击小鼠56天后存活曲线显示,敲除株ΔRv2346c处理的C57BL/6小鼠显示出比标准株H37Rv和回补株ΔRv2346c/ΔRv2346c::p MV261处理的小鼠有更高的存活率(P<0.05);在结核杆菌攻击小鼠35天后,敲除株组细菌载量远低于标准株和回补株组观察到的细菌载量(P<0.05)。肺组织病理结果显示,PBS、BCG及H37Ra组肺组织基本正常,标准株组和回补株组的肺实质中皆观察到许多炎症病灶,但敲除株组轻于前两组。HE染色显示,标准株组和回补株组的炎性面积基本相同,但敲除株组明显轻于前两组(P<0.05);免疫荧光结果显示,标准株组和敲除株组的F4/80数量分布大体相似,但敲除株组显示更高的TNF-α和IL-6荧光强度。结论:(1)成功构建了噬菌体介导的结核分枝杆菌Rv2346c基因敲除株;(2)重组蛋白Rv2346c能抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7及U937对BCG的免疫灭活效应,Rv2346c敲除则能够显著降低结核分枝杆菌的体内毒性,其机制可能与Rv2346c通过抑制巨噬细胞的TNF-α、IL-6的细胞因子分泌和NF-κB p65活化,从而抑制了其细胞免疫功能、继而影响宿主对结核分枝杆菌的清除。