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前言：肺癌在世界范围内是癌症死亡的首要病因,其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例的80％。尽管临床上对于肺癌的诊断及治疗的技术不断发展,但是许多国家肺癌的5年生存率仍低于15％。为了进一步提高肺癌的生存率,人们希望找到疗效好且不良反应低的治疗肺癌的药物。近年来从中药中提取的天然化合物因其广泛的生物活性、低毒性和较少的副作用而备受关注。
蛇床子素,7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素,是蛇床子中活性成分,蛇床子素可以从许多药用植物中提取,如蛇床子及其他植物。在我国的传统中医中,蛇床子素长期以来被用于治疗湿疹,皮肤搔痒,阴道滴虫感染及性功能障碍等。最近的研究表明蛇床子素可能具有抑制增殖,扩张血管,抗炎,抗微生物,抗过敏及预防肝炎等作用。此外,蛇床子素的抗肿瘤作用已经有所报道。这些研究表明,蛇床子素能抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移。然而,蛇床子素对人类肺癌细胞的影响及机制目前仍不清楚。
本研究探讨天然化合物蛇床子素(Osthole)对肺癌的抗肿瘤作用,对蛇床子素对肺癌A549细胞系增殖、周期、凋亡、侵袭的影响及机制进行初步探讨。为深入研究蛇床子素抗肿瘤机制提供试验基础。
材料与方法：
一、蛇床子素对肺癌A549细胞增殖、周期的影响的研究
1、采用四甲基偶氮噻蓝(MTT)法检测蛇床子素对A549细胞增殖的影响;
2、流式细胞仪检测蛇床子素对A549细胞细胞周期的影响;
3、western blotting检测蛇床子素作用于A549细胞后Cyclin蛋白家族、CDC2等相关蛋白表达。
二、蛇床子素对肺癌A549细胞凋亡的影响的研究
1、采用流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测蛇床子素作用于A549细胞后细胞凋亡情况;
2、荧光显微镜观察蛇床子素作用于A549细胞后细胞形态变化;
3、western blotting检测蛇床子素作用于A549细胞后Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白表达;
4、western blotting检测蛇床子素作用于A549细胞后Akt及p-Akt表达。
三、蛇床子素对肺癌A549细胞侵袭、迁移的影响的研究
1、Transwell小室分析蛇床子素对肺癌A549细胞侵袭的影响;
2、Transwell小室分析蛇床子素对肺癌A549细胞迁移的影响;
3、western blotting检测蛇床子素作用于A549细胞后MMP-2、MMP-9侵袭相关蛋白表达。
结果：
一、蛇床子素对肺癌A549细胞增殖、周期的影响
1、MTT法检测结果显示随着浓度的加大和作用时间的延长,药物对细胞的增殖有明显的抑制作用,呈现明显的时间一剂量效应关系。
2、流式细胞仪进行细胞周期检测,蛇床子素对A549有周期阻滞作用,阻滞于G2/M期。
3、采用western blotting方法检测蛇床子素对细胞周期相关蛋白,随药物浓度增加,Cyclin B1及CDC2表达较少,并具有剂量依赖性。
二、蛇床子素对肺癌A549细胞凋亡影响的研究
1、采用流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡;流式细胞检测细胞凋亡分析表明作用随浓度的增高,早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加,与对照组相比差异具有显著性。
2、荧光电子显微镜观察药物作用后的细胞中可见染色体边集、核碎裂等典型的凋亡改变,而对照组没有相应的变化。
3、采用western blotting方法检测蛇床子素对凋亡相关的蛋白如Bcl-2、Bax的表达的影响。随药物浓度增加,Bax蛋白表达水平逐渐升高,而Bcl-2蛋白表达水平随浓度的增加逐渐降低,Bax/Bcl-2的比值逐渐升高,并呈现剂量依赖性。
4、蛇床子素作用后,采用western blotting方法检测p-Akt逐渐降低,总Akt未见明显变化。
三、蛇床子素对肺癌A549细胞侵袭、迁移的影响的研究
1、应用Transwell小室检测蛇床子素对肺癌A549细胞侵袭、迁移能力的影响,发现蛇床子素处理后实验组细胞的侵袭、迁移能力有明显降低。
2、采用western blotting方法检测MMP-2、MMP-9侵袭相关蛋白表达。随药物浓度的增加,MMP-2、MMP-9表达减少,并具有剂量依赖性。
结论：
1、蛇床子素可以抑制肺癌A549细胞的增殖,这种抑制作用具有时间和浓度依赖性。蛇床子素抑制肺癌A549细胞的增殖可能是通过细胞周期阻滞、诱导其凋亡、抑制其侵袭来实现的。
2、蛇床子素引起A549细胞周期阻滞作用可能与抑制Cyclin B1及CDC2表达有关。
3、蛇床子素可能通过调控Bcl-2家族蛋白的表达引起A549细胞凋亡,可能与抑制PI3K/Akt通路相关。
4、蛇床子素抑制A549细胞的侵袭移动可能与抑制MMP-2、MMP-9表达有关。