研究背景结肠癌是发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,是人类的一种高发性恶性肿瘤,其发病率一直呈上升趋势,在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位,严重危害人类健康。肿瘤转移是晚期结肠癌患者死亡的主要原因之一,也是结肠癌临床治疗的难题。结肠癌转移是指结肠癌肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或其它途经转移到其它部位继续生长,形成与原发部位相同类型的肿瘤。结肠癌转移有四种途径,包括直接浸润、淋巴转移、血行转移和种植转移,淋巴转移是结肠癌转移的主要途径。结肠癌转移的具体机制目前仍不清楚,但有报道表明肿瘤微环境（TME）中M2型巨噬细胞对肿瘤的转移有促进作用。巨噬细胞起源于骨髓多能造血干细胞,是单核-巨噬细胞系统中具有吞噬功能的晚期分化细胞,也是构成机体固有免疫防线的重要部分,因其异质性、可塑性以及在维持机体稳态中的重要性而成为医学免疫学研究的重要内容。巨噬细胞按照其膜表面抗原和分泌的细胞因子类型可分为多种亚群,主要有经典活化的M1型巨噬细胞和替代性活化的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞被认为具有促进炎症反应和抗肿瘤免疫功能,而M2型巨噬细胞则表现出抗炎和促进肿瘤进展等作用。肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）,是其中数量最多的免疫细胞,目前主流观点认为TAMs属于M2型激活途径,且TAMs的活化调控在肿瘤的发生发展和治疗过程中扮演着重要角色。M2型巨噬细胞分泌多种抗炎因子、免疫抑制因子和肿瘤生长因子,促进血管生成、基质分解和癌细胞运动,这些都是肿瘤细胞生长和转移不可缺少的因素,因此,M2型巨噬细胞是一个很有价值的癌症治疗靶点。然而M2型巨噬细胞在肿瘤转移中的作用机制尚不明确,可能存在多种分子在其中发挥着调控作用,因此,寻找并鉴定新的调控分子对于研究M2型巨噬细胞的功能与癌症治疗具有重要的意义。蛋白4.1R是一种最初在成熟红细胞中发现的膜骨架蛋白组分,在人和小鼠的成熟红细胞中,蛋白4.1R是将跨膜蛋白与细胞骨架网络连接起来的桥梁分子,对维持红细胞的形状和膜稳定性发挥重要作用。后来研究者发现,蛋白4.1R的编码基因EPB41不仅在红细胞中表达,还同样在起源于骨髓造血干细胞的各类免疫细胞中表达并发挥重要调控作用。例如最近有报道显示,在CD8⁺T细胞中,4.1R基因敲除显著增强了IL-2和IFN-γ的分泌水平,促进其活化,而在肥大细胞中,4.1R可在体内和体外正向调节FcεRI信号转导。然而关于蛋白4.1R在M2型巨噬细胞中的作用,目前还未见报道。研究目的本研究利用野生型(4.1R^+/+)和4.1R基因敲除型(4.1R^-/-)C57BL/6小鼠骨髓来源的M2型巨噬细胞,探究蛋白4.1R对M2型巨噬细胞吞噬作用、细胞因子分泌、促肿瘤效应等功能的影响,研究结果有利于揭示蛋白4.1R在M2型巨噬细胞中的新功能。研究方法1.分别提取野生型(4.1R^+/+)和4.1R基因敲除型(4.1R^-/-)C57BL/6小鼠的骨髓细胞,M-CSF和IL-4体外诱导培养使其分化为4.1R^+/+M2型巨噬细胞(M2-4.1R^+/+)和4.1R^-/-M2型巨噬细胞(M2-4.1R^-/-);利用流式细胞术鉴定M2-4.1R^+/+和M2-4.1R^-/-的表型及纯度。2.利用PCR和Western blot技术检测蛋白4.1R在M2-4.1R^+/+和M2-4.1R^-/-中的表达情况。3.荧光微球法检测蛋白4.1R基因敲除对M2型巨噬细胞吞噬作用的影响。4.q RT-PCR检测蛋白4.1R基因敲除对M2型巨噬细胞表达细胞因子的影响;Westerrn blot和ELISA法检测蛋白4.1R基因敲除对M2型巨噬细胞分泌VEGFA的影响。5.将M2-4.1R^+/+和M2-4.1R^-/-分别与小鼠结肠癌细胞MC38共培养。细胞划痕实验检测4.1R基因敲除对M2型巨噬细胞促进MC38细胞伤口愈合能力的影响;Transwell实验检测4.1R基因敲除对M2型巨噬细胞促进MC38细胞迁移和侵袭能力的影响;CCK-8法检测4.1R基因敲除对M2型巨噬细胞促进MC38细胞增殖能力的影响;Western blot法检测4.1R基因敲除对M2型巨噬细胞促进MC38细胞上皮-间质转化（EMT）过程的影响。6.将M2-4.1R^+/+和M2-4.1R^-/-分别与MC38细胞按1:2比例混合后,皮下注射于BALB/c无胸腺裸鼠侧腹,观察记录肿瘤的体积变化情况,最后收集肿瘤组织,拍照并称重。7.使用VEGFA处理MC38细胞,以及在M2-4.1R^-/-和MC38细胞的共培养系统中加入VEGFA中和抗体后,利用Transwell实验和Western blot法检测M2-4.1R^-/-中VEGFA分泌增加对MC38细胞迁移、侵袭和EMT过程的影响。8.在M2-4.1R^-/-和MC38细胞的共培养系统中加入PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后,利用Transwell实验和Western blot法检测M2-4.1R^-/-中VEGFA分泌增加对MC38细胞PI3K/Akt信号通路激活状态的影响。研究结果1.成功诱导了M2-4.1R^+/+和M2-4.1R^-/-,为后续实验奠定了基础。2.PCR和Western blot技术检测结果显示:蛋白4.1R在M2-4.1R^+/+中正常表达,在M2-4.1R^-/-中表达缺失。3.荧光微球法检测发现:M2-4.1R^+/+吞噬能力显著高于M2-4.1R^-/-。4.q RT-PCR、Westerrn blot和ELISA检测发现:M2-4.1R^-/-分泌的VEGFA显著高于M2-4.1R^+/+。5.在体外,将M2-4.1R^+/+和M2-4.1R^-/-分别与MC38细胞共培养后,测定MC38细胞的增殖、迁移、侵袭等功能。结果发现:相比于M2-4.1R^+/+,与M2-4.1R^-/-共培养后,MC38细胞的伤口愈合、迁移、侵袭、增殖能力和EMT过程均得到显著促进。6.在体内,利用BALB/c无胸腺裸鼠皮下瘤移植模型检测M2-4.1R^+/+和M2-4.1R^-/-对MC38肿瘤生长的影响。结果发现:相比于M2-4.1R^+/+,MC38细胞与M2-4.1R^-/-混合后形成的肿瘤体积更大,生长速度更快。7.VEGFA显著增强MC38细胞的迁移、侵袭能力和EMT过程,且中和M2-4.1R^-/-分泌的VEGFA活性后,MC38细胞的迁移、侵袭能力和EMT过程被显著抑制。8.PI3K/Akt信号通路抑制剂显著抑制了与M2-4.1R^-/-共培养后的MC38细胞的迁移、侵袭能力和EMT过程。研究结论1.蛋白4.1R提升M2型巨噬细胞的吞噬作用。2.蛋白4.1R抑制M2型巨噬细胞的促肿瘤效应。3.蛋白4.1R通过下调M2型巨噬细胞分泌VEGFA,抑制结肠癌细胞的PI3K/Akt信号通路进而抑制其转移。