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山胡椒（Lindera glauca）具有适应性强、种质资源分布广以及果实油脂含量丰富等特点,是一种新型的木本生物柴油物种,其油脂累积分子机制值得深入探究。本研究聚焦于探究山胡椒果实发育中miRNA及其靶标介导的油脂累积分子网络调控机制,为此,拟以不同发育期山胡椒果实为试材,分析其果实生长发育规律及油脂积累模式,并开展不同发育果实mRNA及miRNA高通量测序分析,筛选得到与油脂累积密切相关的功能基因及转录因子和miRNAs,进而建立山胡椒果实油脂累积调控网络;在此基础上,选取与果实油脂累积相关的lgl-miR171a为研究切入点,分析其响应果实发育及油脂累积的转录表达机制,进行下游靶基因LgSCL6的剪切位点验证及互作分析;此外,开展lgl-MIR171a和LgSCL6基因遗传转化拟南芥研究,通过对不同基因型植株（野生型、突变缺失、过表达和突变恢复）的表型及油脂累积关键基因表达分析,从中探究山胡椒果实lgl-miR171a/LgSCL6介导的油脂累积分子调控机制。通过上述研究,可得到如下主要结果:1.依据山胡椒果实发育变化与油脂动态累积模式,其发育期可分为三个主要阶段:发育早期（25-75 DAF）、发育中期（75-125 DAF）和发育后期（125-175 DAF）,其中25-75 DAF阶段果实重量和大小显著增加,而油脂累积较低;75-125 DAF阶段果实生长缓慢或趋于停滞,但油脂累积迅速,从3.58%（75 DAF）增加到17.34%（125DAF）;125-175 DAF为果实形态成熟阶段,期间果皮颜色逐渐加深,果实含油率于150 DAF达到最高值（31.25%）。此外,山胡椒果实油共检测出8种脂肪酸成分,分别为C10:0、C12:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2和C18:3,其中C18:1（油酸）在完全成熟果实（175 DAF）中含量最高（34.95%）,是山胡椒果实油的主要脂肪酸成分。这些结果表明,山胡椒果实油脂累积响应果实生长发育进程。2.基于山胡椒果实发育和油脂累积规律,筛选3个发育期果实（50、125和150DAF）,开展其mRNA转录组测序,共获得69,160条unigenes,以50 DAF样品为对照,确定2,854条基因在不同发育果实中显著差异性表达;通过功能注释,获得346个与果实油脂累积密切相关的功能基因及转录因子（如SUS3、质体PDC、ACCase、FATA、DGAT1、ABI3及WRI1等）。在此基础上,以不同发育果实为试材,开展miRNA转录组测序分析,共获得312个山胡椒果实miRNAs,其中284个miRNAs响应果实发育的差异转录表达,属于39个miRNA家族;通过整合mRNA与miRNA高通量测序分析,以及靶基因预测及注释,确定1,137个靶基因,主要涉及转录调控和激素信号传导（例如miR156/SPL、miR171/SCL6、miR172/AP2、miR166/PHB、miR393/TIR1、miR160/ARF等）;综合miRNA转录表达图谱及蛋白互作分析与q RT-PCR结果,建立miRNA介导的山胡椒果实油脂累积调控网络,其中lgl-miR171a/LgSCL6处于调控枢纽的关键位置,以此为切入点进行后续深入研究。3.依据山胡椒果实mRNA和miRNA转录组测序数据,成功克隆获得lgl-MIR171a基因前体序列（570 bp）,预测其能够形成稳定的发卡结构（最低自由能-34.60 kcal/mol）。q RT-PCR分析表明,lgl-miR171a在山胡椒的花及果实和叶片中表达丰富,但在茎和根部等组织低表达或未有表达,而且其表达随着果实发育进程逐渐上调,表明lgl-miR171a表达具有组织特异性和响应果实发育特性。4.通过染色体步移技术,克隆获得lgl-MIR171a基因全长启动子序列（1,432 bp）,含有多种胁迫（光、盐、干旱和机械损伤等）及激素信号（茉莉酸、生长素和赤霉素等）响应元件等;Pr OMIR171a启动子驱动GUS基因表达分析结果表明,转基因拟南芥幼苗真叶、成熟植株叶片、花序中均有GUS活性,且其随果荚发育进程而增强,但在幼苗胚轴和根以及成熟植株茎中均未见GUS活性,这充分说明Pr OMIR171a是一个组织特异性及响应果实发育特性启动子;为有效确定Pr OMIR171a启动子的关键调控区域,开展启动子全长及5’缺失转化烟草研究,结果显示,Pr OMIR171a驱动GUS基因转录水平随5’缺失启动子片段长度变短（1,432至569 bp）而逐渐减弱,主要涉及到响应光胁迫（-1432/-311区）,Me JA、干旱和机械损伤胁迫（-1432/-570）,IAA诱导（-1432/-830）,及盐诱导（-1432/-1061）。上述结果表明山胡椒果实lgl-miR171a转录表达调控机制极为复杂。5.依据山胡椒果实mRNA转录组测序数据,扩增获得lgl-MIR171a靶基因LgSCL6序列,其ORF长为2,334 bp,可编码777个氨基酸（84.15 k Da）;通过亚细胞定位分析,确定LgSCL6为核转录因子;通过基于5’RLM-RACE的切割位点验证及lgl-MIR171a和LgSCL6-GUS瞬时共转化烟草研究,证实lgl-miR171a负调控LgSCL6基因的转录表达。6.开展lgl-MIR171a和LgSCL6表达载体构建及遗传转化拟南芥,并对不同基因型(WT、LgSCL6-OX、lgl-MIR171a-OX、ProMIR171a::MIR171a、mir171a以及lgl-MIR171a/mir171a)植株表型进行分析。结果表明,与野生型植株相比,35S启动子驱动的山胡椒果实lgl-MIR171a在拟南芥中表达,可引起植株根长变短和分枝减少,但可促进株高及叶片叶绿素含量和种子重量增加,这与山胡椒果实LgSCL6异源表达或mir171a突变对拟南芥植株表型的影响效应相反,而mir171a突变恢复植株表型与野生型差异极小,说明外源lgl-MIR171a表达可恢复拟南芥mir171a突变产生的不良影响,进而表明lgl-miR171a可通过剪切抑制其靶基因LgSCL6表达而调控植株生长及种子发育;此外,Pro MIR171a::MIR171a植株中仅表现出叶片叶绿素含量增加,反映出Pro MIR171a启动子驱动的lgl-MIR171a表达,与35S启动子相比,不会对植株的发育产生多效性影响。7.对不同基因型拟南芥植株中种子油脂累积变化及其关键基因表达进行检测分析,结果表明,与野生型相比,Pro MIR171a::MIR171a转基因拟南芥种子油脂含量明显增加、尤其C18:2、C18:3以及C20:1脂肪酸含量显著增加,但其他转基因或突变体种子中油脂及其脂肪酸组分含量均有不同程度下降,反映出Pro MIR171a启动子驱动的lgl-MIR171a表达,可有效促进转基因拟南芥种子油脂的合成累积。q RT-PCR检测结果表明,mir171a突变与LgSCL6过表达可引起油脂累积关键基因表达的下调,但利用外源lgl-MIR171a回补mir171a突变,可促进油脂累积相关基因的恢复表达,表明lgl-miR171a对LgSCL6表达的负调控对油脂累积关键基因的正常表达至关重要;此外,lgl-MIR171a基因在Pro MIR171a启动子驱动下的表达与35S启动子相比,可促进转基因拟南芥果荚油脂累积关键基因的表达,但明显抑制SCL6表达。上述结果表明,山胡椒果实Pro MIR171a启动子调控的lgl-miR171a转录表达响应果实发育,通过抑制靶基因LgSCL6表达,促进油脂累积密切相关基因表达,进而有助于发育果实油脂累积。本研究从mRNA和miRNA组学联合分析以及lgl-miR171a及其靶基因LgSCL6功能鉴定等不同层次上,确定山胡椒发育果实过程中油脂累积密切相关的mRNAs及miRNAs,进而通过功能分析,揭示lgl-miR171a负调控LgSCL6而促进果实油脂累积的分子网络机制。本研究结果可为后续研究miRNA及其靶基因介导的植物果实油脂累积调控机制提供科学依据,以期不久的将来应用于山胡椒及经济林木油料作物的分子精准改良育种,具有重要的学术价值和应用前景。