目的:食管癌是食管鳞状上皮或腺上皮异常增生所形成的恶性病变,位居世界癌症致死疾病的第六位,其高发病率和高死亡率已引起广泛重视。食管鳞状上皮不典型增生是食管癌重要的癌前病变,而从食管鳞状上皮不典型增生发展到癌变一般需要几年甚至十几年,该阶段是食管癌早诊早治的最宝贵时机。如果早期发现轻、中度不典型增生并对该部分群体进行干预促使其逆转,那么将大幅降低其癌变的几率。因此,食管癌癌前病变的早期识别和干预对降低其癌变率、促进食管癌的防治均具有重要意义。国家自2008年起在山东省肥城市针对该地区40～69岁的人群,借助内镜下碘染色指示性活检技术,筛查处于不典型增生的癌前病变状态或早期食管癌的病例。但即使是在食管癌高发区,其食管粘膜病变筛检阳性率也较低。高达90%的人筛查结果为阴性,承受着不必要的有创内镜检查痛苦。因此,急需开发一种新方法,用于探寻在食管癌发生发展阶段机体内环境的变化,为食管癌的金标准筛检方法(内镜下碘染色指示性活检技术)提供初筛的科学依据和转化医学支持,以区分内镜下食管粘膜病变筛检阳性者和食管粘膜病变筛检阴性者,缩小内镜筛查的范围,提高内镜筛查的阳性率,从而避免食管完全健康的人群承受有创内镜的痛苦,使得食管癌的早诊早治更具针对性。虽然以往的食管癌代谢组学研究发现了氨基酸代谢、能量代谢以及脂质代谢等多条代谢通路的扰动和异常,但大多数研究都是传统的基于医院的病例对照设计,仅能发现中晚期食管癌患者与健康对照者的代谢轮廓差异,不能用于早期筛检。本项目依托“国家食管癌早诊早治示范基地”,收集初次发现的内镜下食管粘膜病变筛检阳性者(包括食管炎、食管癌癌前病变和早期患者、中晚期食管癌患者)和食管粘膜病变筛检阴性者(无上消化道病变的健康对象)的血清样品,建立基于人群的食管粘膜病变筛检代谢轮廓研究,克服了基于医院的病例对照研究缺乏食管癌癌前病变和早期病例的缺憾。本研究旨在建立基于人群的代谢组学病例对照研究,借助超高效液相四级杆串联飞行时间色谱质谱联用仪(UPLC/QTOF/MS)检测平台,应用统计模式识别和其他统计方法,筛选出用于食管癌高发区初筛的代谢组学指标,并建立食管粘膜病变筛检阳性者与阴性者的判别模型,从而缩小内镜筛查的范围,仅对高危个体进行内镜检查,对于食管癌筛检的实施和推广有着重要的意义。方法:本研究使用UPLC/QTOF/MS检测平台对所收集的血清样品进行代谢轮廓分析。所获得的代谢组学数据经过预处理和数据质量评价后,应用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)探索食管粘膜病变筛检阳性者和阴性者间的代谢轮廓差异和分类趋势。通过PLS-DA模型的变量重要性评分(VIP),单变量的非参数检验以及代谢物对内镜下食管粘膜病变筛检阳性/阴性诊断的AUC值等方法筛选差异代谢物。进一步查看原始色谱质谱数据,去除明显的噪声,根据R软件的CAMERA包识别同一代谢物的同位素离子、加合离子及碎片,从而有效地筛选潜在的代谢标志物。根据代谢物的保留时间、一级质谱或二级质谱实验获得的碎片离子裂解规律,用数据库检索、标准品鉴定等方法,对潜在代谢标志物进行了结构鉴定。将样本分为两部分,一部分用来构建区分内镜下食管粘膜病变筛检阳性者与阴性者的初筛模型,另一部分用于验证模型的有效性。结果:共收集内镜下食管粘膜病变筛检阳性者和阴性者血清样品641例。其中内镜下食管粘膜病变筛检阴性者187例,内镜下食管粘膜病变筛检阳性者共454例,包括食管炎症95例(占20.93%),轻度不典型增生184例(占40.53%),中度和重度不典型增生133例(占29.30%),原位癌和筛查出来的食管鳞癌42例(占9.29%)。使用UPLC/QTOF/MS检测平台对所采集的血清样品打乱分组顺序进行代谢轮廓分析。所获得的代谢组学数据经过预处理后,在正离子检测模式的UPLC-MS谱生成的数据矩阵中发现了 522个变量,而在负离子检测模式下发现了 212个变量。从而获得可用于统计分析的2维标准数据格式,并使用R语言CAMERA软件包给出代谢物碎片、加合物、同位素等化学物质的标识信息。采用相对标准偏差和主成分分析评价实验过程中的质量控制,各代谢物的相对标准偏差分布图和质控样本的主成分得分图显示实验过程中质量控制良好,实验数据真实可信。主成分分析结果发现食管粘膜病变筛检阳性者和阴性者间具有初步的组间分类趋势,但不同组之间有一定程度的重合。因此使用PLS-DA分析进行有监督模式识别。其建模的R2X=0.231,R2Y=0.749,Q2cum=0.638,说明食管粘膜病变筛检阳性者和阴性者间具有代谢模式差异和明显的组间分类趋势,响应排序检验验证图显示PLS-DA模型无过拟合风险。根据变量重要性评分、单变量的非参数检验以及代谢物对内镜下食管粘膜病变筛检阳性/阴性诊断的AUC值等方法共筛选潜在代谢标志物22个。结合代谢物的保留时间、一级质谱或二级质谱实验获得的碎片离子裂解规律,数据库检索,标准品鉴定等方法,对潜在代谢标志物进行了结构鉴定。目前共确定了3个主要代谢标志物的结构,分别为L-色氨酸、苦豆碱和鞘氨醇-1-磷酸。根据潜在代谢标志物的鉴定结果及在代谢通路中起的作用,本研究发现内镜下食管粘膜病变筛检阳性者中氨基酸和膜磷脂代谢途径发生紊乱。将样本按比例随机分配2/3作为训练集,另外1/3作为测试集。使用训练集数据的734个变量构建PLS-DA和随机森林模型以区分内镜下食管粘膜病变筛检阳性者和阴性者。随机森林模型预测测试集分类的ROC曲线下面积为0.994,测试集获得的PLS-DA三维得分图在食管粘膜病变筛检阳性组和阴性组间存在着明显的组间分类趋势,说明应用血清代谢标志物构建的模型可有效区分内镜下食管粘膜病变筛检阳性者和阴性者。利用已经鉴定出结构的代谢标志物L-色氨酸、苦豆碱和鞘氨醇-1-磷酸建立logistic回归模型,根据测试集数据在logistic回归模型所获得的预测值和真实值画出ROC曲线,AUC为0.835,其95%置信区间为(0.776,0.894),说明建模效果良好。结论:使用已经鉴定出结构的代谢标志物L-色氨酸、苦豆碱和鞘氨醇-1-磷酸构建食管癌初筛模型,测试集结果表明建模效果良好。食管粘膜病变筛检阳性者的血清中发生了代谢组学生物标志物和相应代谢通路变化,氨基酸和膜磷脂代谢通路发生了明显的代谢扰动。