研究背景腋窝淋巴结(axillary lymph ndoe, ALN)是乳腺癌最常见和最先转移的部位,是早期乳腺癌病人重要的独立预后因子,准确的ALN分期对局部治疗的选择、全身综合治疗决策和预后判断等具有重要的指导作用。前哨淋巴结活检术(sentinel lymph node biopsy, SLNB)是一项腋窝准确分期的微创活检技术,循证医学Ⅰ级证据证实,对ALN临床阴性患者,SLNB可安全而有效地替代腋窝淋巴结清扫术(axillary lymph node dissection, ALND),显著减少并发症,改善生活质量。但是SLNB的开展有其特定的适应证和禁忌证,且需要特殊染料和术中多学科协作,开展困难。如果SLNB阳性需二次ALND,不仅增加并发症概率而且浪费医疗资源。准确的术前ALN分期能将本该行SLNB的ALN阳性患者通过更微创的穿刺活检筛选出来直接接受ALND.腋窝超声检查(axillary ultrasonography, AUS)是目前最常用的ALN分期影像学技术,腋窝超声引导下的穿刺活检(axillary ultrasound-guided biopsy, AUSB)能取得病理结果,是最可靠的术前腋窝分期手段。但目前缺乏统一、具体的ALN超声诊断细则和分级标准,穿刺方式的选择亦缺乏参考依据。尽管AUSB能额外筛选出25%的患者避免SLNB,仍有25%的患者SLNB阳性,需行二次ALND.为进一步筛选AUSB评估假阴性的淋巴结转移患者,我们试图客观评价超声在ALN分期中的临床应用价值,用临床、病理、超声特征构建ALN预测模型,制定ALN超声分级诊断标准,并寻找淋巴结无转移患者和转移患者之间是否存在差异表达的miRNA或蛋白,作为协助ALN术前分期的参考指标,优化乳腺癌术前ALN分期评估流程。方法ALN超声诊断应用部分首先本研究前瞻性分析2010年4月至2014年12月期间708例我院肿瘤外科本人所在医疗组连续收治住院的所有初诊原发性乳腺癌患者,收集相关临床病理资料和ALN超声图像特征,构建乳腺癌数据库。本研究入组标准为无远处转移的病理确诊为原发性浸润性乳腺癌女性患者,最终572例患者纳入研究,以皮质厚度超过3mm为ALN转移超声主要诊断标准,对可疑淋巴结进行细针穿刺活检(fine needle aspiration, FNA)/粗针穿刺活检(core needle biopsy, CNB).以手术分期的病理结果(未接受新辅助化疗者)或ALN穿刺阳性病理结果(新辅助化疗者)为金标准,比较临床查体(Physical examination, PE)、AUS和AUSB三种ALN分期手段的诊断效能；比较同一淋巴结FNA和CNB的诊断效能；单因素和多因素分析可能与ALN转移相关的临床、病理、超声变量,logistic回归构建转移预测模型并验证,绘制建模组和验证组接收者工作特征(receiver-operator characteristic, ROC)曲线,计算曲线下面积(areas under the ROC curves, AUC),评价模型的预测能力；参考乳腺原发肿块乳腺影像报告和数据系统(Breast Imaging Reporting and Data System, BI-RADS)分级标准,以皮质厚度为主要参考指标,划定不同的临界值作为分级诊断标准,给出符合标准的诊断标准和典型图像作为参考。结合图像分类和对应的ALN阳性率和穿刺准确性推荐各级ALN穿刺方式。据此结果起草乳腺癌ALN超声诊断规范、BI-RADS分级标准和推荐处理方式。miRNA部分其次,对38例乳腺癌原发灶组织提取的RNA进行Agilent miRNA芯片和mRNA表达谱芯片分析,其中ALN无转移和转移各19例,两组患者按年龄、原发灶大小、病理类型严格匹配。Gene Spring GX软件分析芯片检测结果,选取2倍以上差异表达的miRNA,进一步行定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证表达,筛选出可预测乳腺癌ALN转移的miRNA分子标记物,生物信息学方法构建模型并进一步验证和评价。MALDI-TOF-TOF MS部分最后,用表面增强激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)高通量分析筛选乳腺癌ALN无转移和转移患者血清中的差异表达蛋白质峰,生物信息学方法选取显著差异表达的蛋白峰作为生物标记物。研究所选血清样本共190例：浸润性乳腺癌172例,其中ALN无转移87例,ALN转移85例；非浸润性癌18例。将62例ALN无转移和60例ALN转移患者血清定为训练和验证组,将余下的25例ALN无转移、25例ALN转移和18例非浸润性癌定为盲法测试组。盲法测试组中25例ALN转移病例中11例AUSB阳性,14例AUSB假阴性。质谱原始数据预处理、归一化后,过滤法和模型依赖法相结合提取特征向量,筛选候选标志物。遗传算法结合模式识别组合构建预测乳腺癌ALN转移蛋白质谱模型,10倍交叉法验证和评估模型的准确率,盲法测试组进一步验证模型预测效能,计算诊断敏感性、特异性、准确率、阴性预测值(negative predictive value, NPV)和阳性预测值(positive predictive value, PPV),结合ALN超声评价临床应用价值。结果ALN超声诊断应用部分572例患者研究结果：PE的敏感性和特异性分别为41.8%和92.2%,PPV和NPV分别为82.1%和65.1%。AUS的敏感性和特异性分别为77.9%和81.9%,PPV和NPV分别为78.5%和81.4%。AUSB的敏感性和特异性分别为69.6%和100%,PPV和NPV分别为100%和80%。PE、AUS、AUSB在ALN分期的准确率分别为69.1%、80.1%和86.3%,Youden指数分别为34%、59.8%和69.6%。对三种ALNALN分期评估手段比较后发现,敏感性：AUS>AUSB>PE,特异性：AUSB>PE>AUS,PPV:AUSB>PE> AUS, NPV:AUS> AUSB>PE,准确性和Youden指数：AUSB >AUS>PE。统计学检验P<0.05,有显著统计学差异。214例接受接受AUSB的患者中,151例接受了FNA,209例接受了CNB,146例同时接受了FNA+CNB。对146例同时接受两种活检方式病例中FNA和CNB各自的诊断效能,两者敏感性分别为67.2%和91.8%,NPV为37.5%和70.6%,准确性为72.6%和93.2%,特异性和PPV两组均为100%。FNA和CNB联合诊断的敏感性为95.9%,准确性为96.6%,NPV为82.8%。FNA、CNB、FNA+CNB三种活检方式诊断效能排序为FNA+CNB>CNB>FNA, McNemar法两两比较CNB> FNA,有显著统计学差异(p<0.001),但是FNA+CNB> CNB无统计学差异(p=0.063)。两种穿刺方式均无明显严重不良反应,患者耐受性好。将572例患者分为两组：2014年以前的367例患者为建模组,2014年的205；例患者为验证组。建模组和验证组ALN转移率分别为47.1%和43.9%,经检验各特征变量两组间分布基本无显著统计学差异。综合单因素分析和多因素分析结果显示,原发灶大小和位置、ER、PR、Her-2、超声淋巴结皮质和髓质厚度、超声淋巴结水平直径和垂直直径、超声淋巴结是否分叶、淋巴结是否临床可触及可能与ALN转移显著相关。28个临床病理和超声图像特征变量logistic回归构建模型(模型1),建模组和验证组模型预测准确度分别为91%和85.5%。绘制ROC曲线,建模组和验证组AUC分别为0.91(95% CI：0.87-0.95)和0.88(95% CI：0.82-0.93)。10个乳腺原发肿块和ALN超声变量构建回归模型(模型2),建模组和验证组模型预测准确度分别为84.1%和81.8%。绘制ROC曲线,建模组和验证组AUC分别为0.93(95% CI：0.91-0.96)和0.91(95% CI：0.86-0.95)。模型2与模型1相比,精简了变量,ROC曲线的AUC值并未下降,相比反而略有提高。从临床应用的目的分析,模型1能筛选出更多ALN阳性的患者,更符合研究目的。模型1似乎更具有临床应用潜力,但模型2所用参数较少,便于推广,是简化版的易用模型。以ALN皮质厚度为主要诊断标准,按等级分类,初步制定了乳腺癌ALN超声诊断BI-RADS分级诊断标准.logistic回归分析容易出现AUSB假阴性的特征为：原发灶直径1-3cm,AUS评估皮质厚度≤0.36cm,病理组织学分级Ⅰ级,分子分型为Luminal A型。分析各BI-RADS分级标准中ALN-FNA、ALN-CNB穿刺结果,结合卫生经济成本、时间和人力资源成本、安全性和患者主观感受,各BI-RADS分级推荐处理方式如下：BI-RADS 3级 SLNBBI-RADS 4A SLNB/CNBBI-RADS 4B CNB/SLNBBI-RADS 4C CNB/FNABI-RADS 5 FNA/CNBmiRNA部分38例原发灶组织提取的RNA样本质检结果符合要求,miRNA芯片检测各组数据基本对称。Gene Spring GX软件将原始数据归一化和分析后未发现2倍以上有统计学差异表达的miRNA。将P值的cut-off值调高至0.15,发现两个2倍以上差异表达的miRNA,分别是miRNA-1305和miRNA-886-3p。将4对乳腺癌ALN无转移和有转移患者血清等比例混样成1对样本后行血清miRNA芯片分析筛选出miRNA-190a等多个显著差异表达的miRNA,但由于前期原发灶组织miRNA芯片阴性结果及样本量不足等原因,本部分研究暂时终止,未进行下一步验证和模型构建的研究。MALDI-TOF-TOFMS部分训练和验证组共筛选出显著差异表达的28个峰,其中12个表达峰在ALN转移组高表达,16个蛋白峰在转移组低表达。用遗传算法筛选出15个差异表达最显著的蛋白峰构建乳腺癌ALN转移预测模型,7个在ALN转移组高表达,分别为2022、2093、2699、4055、4321、4790、4966；8个在ALN转移组低表达,分别为1597、2953、3218、3317、5907、6435、6633、6650。利用ZJUPDAS软件分析并构建乳腺癌ALN转移预测模型,验证准确率在ALN无转移组为85.48%,在ALN转移组为81.67%。模型验证的敏感性为81.7%,特异性为85.5%,准确率为83.6%,PPV为84.5%,NPV为82.8%。将盲法测试组中18例非浸润性癌病例视为ALN无转移病例,分析43例ALN无转移和25例ALN转移样本,盲法测试模型预测敏感性和特异性为24%和48.8%,准确率为39.7%,PPV和NPV分别为21.4%和52.5%(P<0.05)。将盲法测试组中18例非浸润性癌病例剔除,仅分析25例ALN无转移和25例ALN转移样本,盲法测试模型预测敏感性和特异性为24%和56%,准确率为40%,PPV和NPV分别为35.3%和42.4%(P>0.05)。将盲法测试组中18例非浸润性癌病例和11例AUSB阳性病例剔除,仅分析25例ALN无转移和14例AUSB假阴性样本,盲法测试模型预测敏感性和特异性为24%和56%,准确率为40%,PPV和NPV分别为21.4%和56%(P>0.05)。结论ALN超声诊断应用部分与PE和AUS相比,AUSB是乳腺癌ALN分期中最优的术前评估手段,能提高ALN转移患者的术前检出率,避免不必要的SLNB。与FNA相比,CNB是首选的ALN穿刺活检方式。由超声原发灶层次和是否有钙化、ALN皮质厚度、ALN髓质厚度组成的简化版ALN预测模型诊断效能良好(验证组AUC=0.91),可进一步通过多中心大样本验证后在临床推广应用。以皮质厚度为主要诊断标准的ALN超声诊断BI-RADS分级标准和相应的处理推荐能更好地指导临床开展个体化ALN术前分期,是优化的腋窝评估流程。miRNA部分本研究未通过19对原发灶组织miRNA芯片筛选找到显著差异表达的miRNA作为预测ALN转移的标志物。血清miRNA芯片由于样本量不足无法评价。我们推测也许原发灶组织可能并不存在敏感的差异表达miRNA,也可能是由于本研究样本量不足无法找到差异,待后续扩大样本进一步研究。MALDI-TOF-TOF MS部分磁珠结合MALDI-TOF-TOF MS对乳腺癌ALN转移预测的敏感性较低,特异性中等。盲法测试组由于样本量较少,后两组结果Fisher精确检验P>0.05,无显著统计学差异。后续研究中应该进一步扩大样本量,尤其多收集AUSB假阴性或ALN超声BI-RADS分级为4级的患者,以全面评估乳腺癌ALN转移血清MALDI质谱模型的临床应用价值。结合临床应用实际,在AUSB假阴性的患者中模型预测准确率虽然不高,但在AUSB评估后能进一步筛选出21.4%的ALN阳性患者,如果结合预测结果,进一步行"second-look"的AUS,或许能有额外收获,使更多的患者避免不必要的SLNB.