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肿瘤是内外因交互、多基因、多步骤、多阶段的复杂疾病。化学因素、生物因素和物理因素是目前已知与恶性肿瘤发生密切相关的环境致癌因素。其中的生物性致癌因素尤其是与肿瘤相关病毒,是目前肿瘤病因学研究的热点。大量临床流行病学资料和广泛的病毒学研究显示:15-20%恶性肿瘤与病毒感染关系密切,如宫颈癌与人类乳头状瘤病毒(HPV),肝细胞癌(HCC)与乙型肝炎病毒(HBV),成人T细胞白血病与人类T细胞白血病病毒Ⅰ型,卡波氏肉瘤和淋巴瘤与人类免疫缺陷病毒(HIV)等[1]。 随着对肿瘤病因学研究的不断深入,人类逐渐意识到肿瘤的预防是抗击肿瘤最有效的武器[2]。HBV或HIV感染的防治能阻止或减缓慢性乙型肝炎或艾滋病病程,从而降低HCC及HIV相关恶性肿瘤的发生率。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B-editing catalytic polypeptide 3G,APOBEC3G)是一种新近发现人体细胞内具有抗病毒活性的胞嘧啶脱氨酶家族成员[3-11]。在HIV逆转录复制过程中APOBEC3G主要通过其胞嘧啶脱氨突变作用使得病毒DNA复制水平显著降低[12-16]。HIV—Ⅰ型编码一种称为病毒侵染因子(virioninfectivitv factor,Vif)的蛋白,该蛋白介导APOBEC3G蛋白泛素化及蛋白酶体降解,使得HIV突破宿主细胞天然抗病毒因子APOBEC3G介导的抗病毒作用[17-25]。而APOBEC3G抑制HIV复制的能力呈剂量依赖性,即使在Vif蛋白存在的情况下,当APOBEC3G表达水平较高时同样能发挥其抑制HIV复制的生物学功能浙江大学博士学位论文〔13;15]。因此个体对不同亚型HIV(HIV一工型和Vif蛋白缺陷的Hlv一H型)感染的易感性、体内HIV基因变异状况和HIV感染者病程进展可能是其体内HIV靶细胞中APOBEC3G表达水平和HIV Vif蛋白的平衡结果〔3一5;9;11;26;27)。通过诱导APOBEC3G蛋白表达增高及阻断Vif蛋白的拮抗作用,将在急性HIV感染预防和艾滋病患者的治疗中发挥重要的作用。 另有研究表明APOBEC3G在瞬时表达 HBv的共转染细胞体系中具有显著抑制HBV复制的生物学功能,且APOBEC3G抑制HBv复制的功能并非依赖其胞喷陡脱氨酶活性,而是通过与HBV核心蛋白HBcAg结合阻止HBV一前基因组RNA包装进入病毒颗粒,进一步阻断和抑制前基因组RNA逆转录生成HBV DNA〔28;29〕。 目前人们对APOBEC3G基因的了解仅限于其抗病毒功能,该基因在人体细胞中的其它生物学功能及其作用机制尚无相关研究报道。已有文献报道胞咤咙脱氨酶家族其它成员APOBECI和AID基因在人体或转基因动物中的过度表达将会导致恶性肿瘤的发生【30~35」。APOBEC3G的基因结构及其蛋白功能与胞啼咙脱氨酶超家族其它成员非常相似,己有学者提出APOBEC3G基因的过度表达可能会导致细胞内基因组不稳定性增加,从而参与恶性肿瘤的发生发展过程[31;36;37〕。 HIV感染和破坏人体中最重要的免疫细胞(CD4T细胞),造成机体免疫抑制,从而合并其他肿瘤相关病毒(如人类疤疹病毒8型、EB病毒等)分别引起卡波氏肉瘤和淋巴瘤等恶性肿瘤【l]。HBv感染是导致HCC发生最主要的病因,80%以上的HCC患者伴有慢性HBV感染,持续HBV感染者发生HCC的机率比正常人高300倍t38]。目前用于治疗肿瘤相关病毒HIV或HBV感染的方法效果均不理想,APOBEC3G抗HIV和HBV生物学功能的发现将为人类防治肿瘤相关病毒感染以及降低病毒相关性恶性肿瘤发生率的基础研究和临床应用提供新的理念和开辟新的途径。 基因的表达状况与其生物学功能的发挥密切相关,但是ApOBEC3G在人体中尤其是HIV或HBv靶组织PBMC或肝脏组织中的表达和调控状况尚有待阐明。迄今APOBEC3G抗HBV功能的研究仅在HBV瞬时复制和表达的共转染体系中进行,在HBV持续复制和表达的肝细胞体系中,该基因是否同样能发挥其抗HBV的生物学功能?由于APOBEC3G具有胞喀咤脱氨突变功能,该基因过度表达后对细胞生物学行为产生的作用值得进一步研究和探讨。浙江大学博士学位论文 为进一步探索和验证APOBEC3G基因的生物学特性和功能,本课题将较系统全面的研究分析APOBEC3G基因在人体组织中的表达和调控状况;验证APOBEC3G基因在HBv持续稳定复制和表达的肝细胞体系中抗HBv的生物学效应及其作用靶点;并进一步观察分析APOBEC3G基因过度表达后对细胞生物学行为产生的影响。通过上述研究,以期为干预阻断HIV或HBV感染,降低病毒相关性恶性肿瘤发生率的理论和应用研究工作提供重要的背景资料,并为APOBEC3G基因与肿瘤发生是否相关提供相应的依据和线索。本课题研究包括以下四部分。第一部分APOBEC3G基因表达谱的研究1.1半定量RT一PCR检测方法的建立 为了定量检测APOBEC3G mRNA的表达水平,本研究建立和优化了RT一PCR反应条件和参数,并以APOBEC3G和p一actin PCR扩增产物电泳条带扫描值的比值作为APOBEC3G表达的相对值。研究结果显示:凝胶电泳和序列分析结果均证实该方法能特异性扩增APOBEC3G mRNA翻斗,全长;PCR扩增模板梯度稀释实验结果显示该方法敏感性较强:不同模板2复孔PCR实验结果显示该方法重复性较强。1.2 APOBEC3G血州A和蛋白在肿瘤细胞系中的表达 应用RT一PCR方法和Western Blot分别检测APOBEC3G mRNA和蛋白在10个实体瘤细胞系和4个白血病?