三株放线菌代谢产物的抗菌活性及理化性质分析

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菌株HD-006、HD-010、HD-087、HD-103、HD-109是黑龙江大学微生物实验室分离并保存的拮抗放线菌。本研究根据对多种植物病原真菌的抑菌活性筛选出3株抑制植物病原真菌效果较好的链霉菌HD-087、HD-103、HD-109,并以这3株菌株为研究对象,分别测定了它们的产抗周期、发酵液的抗菌谱和理化性质,并在此基础上初步研究了3株链霉菌的发酵液对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.glycines)的抑菌机理,并对发酵液中的有效活性成分进行了初步的分离。采用杯碟法确定DBY发酵培养基为适合3株菌株的产抗发酵培养基,在250mL的三角瓶中,菌株HD-087和HD-103的最适发酵体积均为60m L,发酵终点为96h;菌株HD-109的最适发酵体积为30mL,发酵终点为144h。并发现3株链霉菌的发酵液均具有广谱抗植物病原真菌活性,尖孢镰刀菌(F.oxysporum f.sp.glycines)等植物病原真菌均有很强的抑制效果,但对瓜果腐霉及辣椒疫霉没有抑制作用。HD-087和HD-103的发酵液的热稳定性和酸碱稳定性均较好;HD-109的发酵液在酸性条件下稳定性较差;HD-087的发酵液能够较耐受紫外光的照射,但HD-103与HD-109的发酵液对紫外照射敏感,照射3h后活性几乎全部丧失。3株菌的发酵液在4℃与-20℃的环境中发酵液活性降低缓慢,可以长期贮藏;经有机溶剂处理后,3株链霉菌的发酵液的抗菌活性均明显降低;3株菌株的发酵液均不耐受蛋白酶K的处理。采用硫酸铵分段盐析法分离发酵液中的抗菌物质,结果表明,抗菌活性物质主要集中在60%-80%饱和度的硫酸铵沉淀中。采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂对硫酸铵沉淀粗提物进行分离,采用pH值为8.5的0.05M Tris-HCl﹕Tris-HCl-2M Na Cl进行梯度洗脱,其中,HD-087出现2个洗脱峰;HD-103出现3个洗脱峰;HD-109出现1个洗脱峰。抗菌活性检测表明,各菌株的各个洗脱峰均有抑菌活性,但峰1的抑菌活性最好。超滤后发现,洗脱峰中的活性物质分子量较大。进行非变性PAGE电泳后分析发现,3株菌株在669k Da处的条带均具有明显的抑菌活性;Tricine-SDS-PAGE电泳发现,669k Da处的活性条带变性降解,证明其为蛋白质。用3株菌的发酵液分别处理尖孢镰刀菌后,镰刀菌的菌丝体生长均得到抑制。菌丝体干重试验结果表明菌株HD-087、HD-103与HD-109的发酵液对尖孢镰刀菌的抑菌中浓度(EC50)分别为2287μg/mL、1152μg/mL、1362.5μg/m L;3株菌的发酵液均能够抑制尖孢镰刀菌的小分生孢子的萌发,发酵液浓度为624μL/mL时,能够100%抑制孢子萌发。用3株菌的发酵液处理尖孢镰刀菌的菌丝体,电导率无显著性变化,光学显微镜下观察发酵液处理后的菌丝体与对照组的菌丝体无明显差异,说明发酵液中的活性物质对尖孢镰刀菌菌丝体的抑制不是通过改变细胞渗透性导致原生质体内电解质渗漏来起作用的。
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