研究背景:肺癌是全球癌症死亡的主要原因,在我国肺癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤中的第一位。根据病理类型的不同,肺癌可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）,其中NSCLC是临床上最常见的病理类型,约占肺癌总数的85%。随着精准治疗的不断发展,肺癌靶向治疗、抗血管生成治疗及免疫治疗在一定程度上改善患者生活质量,提高患者的生存期,但仍不能大幅度改善患者的预后,未能从根本上改变肺癌患者总体五年生存期较短,五年生存率较低的局面。因此,迫切需要从分子层面深入了解肺癌的发生发展机制,为肺癌的治疗提供新思路,以期能够提高患者的生存期,改善患者的生活质量。CD146是一种Ca2+非依赖性粘附分子,属于免疫球蛋白超家族成员之一,功能涉及细胞跨膜信号传导。该分子首次在黑色素瘤中被发现,与肿瘤的转移和不良预后密切相关。随着对CD146分子研究的不断深入,发现其具有更广泛和复杂的生物学功能,参与多种生理过程,如血管新生、胚胎及神经管的发育等。另外,研究表明CD146分子在肿瘤中同样发挥着重要作用,并与许多不同类型肿瘤的进展、转移和不良预后有关。然而,CD146分子在非小细胞肺癌中发挥的作用尚不清楚。因此,该课题重点探讨CD146分子在非小细胞肺癌转移中的作用,以期丰富肺癌转移理论,为肺癌转移的诊治提供新思路。第一部分CD146分子的表达及临床价值目的:分析公共数据库中CD146分子的表达与肿瘤分期及预后的相关性,探索CD146分子调控非小细胞肺癌的分子途径。方法:1.利用公用数据库GTEx,分析CD146分子在正常组织或器官中的表达水平。2.利用公用数据库TCGA,分析CD146分子在32种肿瘤类型的癌组织及癌旁的表达水平。3.采用方差分析法评估CD146分子在不同肿瘤分期中的表达情况。4.运用Cox比例风险模型对CD146分子表达水平和死亡时间进行建模,评估CD146分子对肿瘤患者生存的影响,并应用R语言绘制森林图。5.利用CCLE数据平台,绘制CD146分子在人类肺癌细胞株的表达量水平及其甲基化水平图谱。6.运用GSVA算法分析TCGA数据库中肺腺癌、肺鳞癌,分析与CD146分子表达差异基因的富集通路。7.运用GSEA算法分析TCGA数据库中肺腺癌、肺鳞癌,CD146分子与EMT通路的调控关系。8.在肺腺癌和肺鳞癌表达谱数据集中筛选和CD146分子表达相关性最显著的2000个基因,利用hallmark数据集进行KEGG通路富集。9.将CD146分子按照中位数分为高低表达组,展示肺腺癌、肺鳞癌组织样本基因与EMT相关基因热图。结果:1.CD146分子在大血管中表达水平较高,在正常组织中表达量较低。2.5种肿瘤类型中CD146分子在肿瘤组织中表达量高于癌旁组织,6种肿瘤类型中CD146分子在肿瘤组织中表达量低于癌旁组织（P＜0.01）。3.CD146分子在总体肿瘤中的表达量和肿瘤分期显著相关,分别对每种肿瘤类型分析发现有6种肿瘤CD146分子的表达量和肿瘤分期显著相关（P＜0.05）。4.5种肿瘤的CD146分子表达量与患者的总生存期显著相关（P＜0.05）。5.黑色素瘤细胞株中CD146分子的表达最高,而血液系统急性髓系白血病肿瘤表达量最低。这些细胞系的RRBS数据显示,CD146分子的表达与DNA启动子甲基化高度相关（P＜0.05）。6.GSVA分析显示:肺腺癌中与CD146分子具有正向调控作用通路有28条,负向调控作用通路有14条;肺鳞癌中与CD146分子具有正向调控作用通路有29条,负向调控作用通路有18条（P＜0.05）。7.GSEA分析显示:肺腺癌和肺鳞癌均显示CD146分子与EMT具有正向调控关系（P＜0.05）。8.KEGG通路分析显示:肺腺癌和肺鳞癌均显示CD146分子与EMT活化显著相关（P＜0.05）。9.单基因热图分析结果显示:CD146分子与EMT通路基因具有相关性。第二部分 CD146分子表达与NSCLC临床资料的相关性分析目的:分析CD146分子的表达与NSCLC临床特征及与患者预后的相关性。方法:1.依据本课题的纳入和排除标准收集NSCLC患者癌组织标本,应用免疫组化技术检测癌组织中CD146分子表达水平,分析CD146分子表达水平与NSCLC患者临床特征之间的相关性。2.评估CD146分子表达水平与患者预后之间的相关性。结果:1.CD146分子表达水平与NSCLC患者淋巴结转移、远处转移及肿瘤TNM分期具有相关性（P＜0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤病理类型、肿瘤大小无相关性（P＞0.05）。2.CD146分子是NSCLC患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05）。第三部分 CD146分子对NSCLC生物学行为的影响及作用机制目的:探究细胞水平调控CD146分子的表达对NSCLC迁移、侵袭能力的影响及作用机制。方法:1.采用western blot法及流式细胞术法筛选NSCLC细胞系中CD146分子高表达、低表达细胞株。2.应用免疫荧光染色技术检测CD146分子表达位置。3.分别利用慢病毒转染H460、A549,构建稳转细胞株并验证转染效率。4.划痕实验及Transwell实验检测CD146分子对细胞迁移能力的影响。5.Transwell（基质胶）侵袭实验检测CD146分子对细胞侵袭能力的影响。6.通过mRNA测序,筛选与CD146分子相关的差异基因。7.对差异基因进行GO分析、KEGG通路富集、GSEA分析,寻找可能的分子通路。8.western blot法检测CD146调控EMT相关蛋白、转录因子及PI3K/Akt通路蛋白变化。9.western blot法检测在敲低或过表达组分别使用PI3K激活剂或抑制剂对EMT相关蛋白、对PI3K/Akt信号通路的变化。结果:1.对8株NSCLC细胞进行筛选,CD146分子高表达细胞株是H460,低表达细胞株是A549。2.免疫荧光实验表明CD146分子定位在细胞膜上。3.利用慢病毒转染技术成功构建H460细胞稳定敲低CD146分子细胞株及A549过表达CD146稳转细胞株（P＜0.05）。4.划痕实验结果显示:在H460细胞中,与对照组相比,shRNA敲低CD146分子组伤口愈合能力减弱;在A549细胞中,与对照组相比,CD146分子过表达组伤口愈合能力增强（P＜0.05）。Transwell实验结果显示:在H460细胞中,与对照组相比,shRNA敲低CD146分子组跨膜细胞减少;在A549细胞中,与对照组相比,CD146分子过表达组组跨膜细胞增多（P＜0.05）。5.Transwell（基质胶）侵袭实验结果显示:在H460细胞中,与对照组相比,shRNA敲低CD146分子组跨膜细胞减少;在A549细胞中,与对照组相比,CD146分子过表达组跨膜细胞增多（P＜0.05）。6.通过测序以FC=2为标准,共筛出324个差异基因。其中174个基因上调,150个基因下调（P＜0.05）。7.通过GO、KEGG、GSEA不同富集方式,富集到有意义的通路集中在细胞粘附、细胞连接、粘着斑、细胞迁移等,均与细胞的迁移、侵袭密切相关（P＜0.05）。8.EMT相关指标及PI3K/Akt通路蛋白检测结果显示:在H460细胞中,敲低组N-cadherin、vimentin、snail、twist、p-PI3K及p-Akt表达减少;在A549 细胞,过表达组E-cadherin表达减少,N-cadherin、vimentin、snail、twist、p-PI3K及p-Akt表达增多（P＜0.05）。9.Western blot实验结果显示:在H460细胞组,PI3K激活剂组与敲低组相比,N-cadherin、vimentin、snail、twist、p-PI3K及p-Akt表达增多;在A549 细胞,PI3K抑制剂组与过表达组相比,E-cadherin表达增多,N-cadherin、vimentin、snail、twist、p-PI3K及p-Akt表达减少（P＜0.05）。第四部分 CD146分子表达对NSCLC裸鼠转移瘤的影响目的:探究调控CD146分子的表达对NSCLC裸鼠转移瘤形成作用的影响。方法:1.将含有luciferase基因的H460-shCtrl-luc、H460-shRNA#1-luc细胞,及A549-pcDNA3.1-luc、A549-pcDNA3.1-CD146-luc细胞分别经尾静脉注射至裸鼠体内,应用小动物活体成像仪观察裸鼠体内形成转移瘤的荧光信号。2.裸鼠处死后剥离出肺组织大体标本,观察形成的转移瘤数目。3.HE染色技术观察转移瘤形成情况。结果:1.成功建立裸鼠转移瘤模型,实验结果显示:在H460组,与对照组相比,H460-shRNA#1-luc组荧光信号明显减弱;在A549组,与对照组相比,A549-pcDNA3.1-CD146-luc组荧光信号明显增强（P＜0.05）。2.裸鼠肺大体标本转移瘤结果显示:在H460组,与对照组相比,H460-shRNA-luc组转移瘤数目减少;在A549 中,与对照组相比,A549-pcDNA3.1-CD146-luc组转移瘤数目增多（P＜0.05）。3.HE染色结果显示:在H460组,与对照组相比,H460-shRNA-luc组病理组织癌巢数量少且面积小;在A549组,与对照组相比,A549-pcDNA3.1-CD146-luc组病理组织癌巢数量多且面积大。结论:1.非小细胞肺癌CD146分子的表达可能与EMT通路正向活化相关。2.非小细胞肺癌组织中CD146分子的表达和肿瘤的淋巴结转移、远处转移及TNM分期相关,且是患者预后不良的独立危险因素。3.CD146分子的表达促进小细胞肺癌的迁移及侵袭能力。4.CD146分子通过激活PI3K/Akt信号通路调控EMT,促进非小细胞肺癌的迁移及侵袭。