背景自体骨是植骨材料的“金标准”,然而取骨会造成严重的并发症,临床需要大量高活性骨替代材料。成骨性、骨诱导性和骨传导性是影响骨愈合的核心因素。羟基磷灰石、β-磷酸三钙、多聚乳酸等合成材料及脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)等天然生物材料缺乏成骨前体细胞和成骨诱导因子,成骨活性十分有限。经典的组织工程骨(tissue engineered bone, TEB)成骨能力良好,但制备过程复杂,难以实现临床转化。骨髓中含有丰富的成骨相关细胞和因子,既往研究表明骨髓局部注射或与支架材料复合可促进骨愈合。通过选择性细胞滞留(selective cell retention,SCR)技术,可以有效地将骨髓中成骨成分富集于疏松多孔材料,从而实现高活性组织工程骨术中构建。由于制备过程中细胞外基质大量丢失,通常用于SCR技术的DBM支架材料骨髓富集效率相对有限,通过表面修饰增强支架材料粘附性是提高富集效率和特异性的有效手段。在前期研究中,课题组采用多聚赖氨酸、RADA-161水凝胶等修饰DBM支架材料,修饰后材料孔径缩小,对细胞物理拦截作用增强,材料骨髓富集效率和成骨能力均显著提高。然而多聚赖氨酸、RADA-161水凝胶缺乏粘附识别信号,富集细胞特异性差,富集后缺乏促进成骨的生物刺激。随着成骨诱导微环境研究不断深入,模拟细胞外基质和周围细胞作用的支架仿生修饰成为骨组织工程领域近年来研究热点。为避免天然蛋白成本高、免疫原性、易酶解和短肽特异性差的缺点,多采用高分子多肽或模拟肽。课题组前期通过整合纤维连接蛋白(fibronectin) Ⅲ 7-10结构域和钙粘蛋白(Cadherin11)胞外片段第1、2结构域构建的异源双分子嵌合式融合蛋白rFN/CDH,该蛋白具有良好的促粘附、促增殖、促成骨效应。本研究拟通过层层自组装技术构建多层rFN/CDH融合蛋白复合物修饰DBM支架材料,改善材料表面性质,从而提高SCR过程中成骨相关成分的富集效率,并在植入体内后持续发挥成骨诱导作用。目的通过层层自组装技术构建基于SCR技术的多层rFN/CDH融合蛋白界面修饰DBM支架材料,增强成骨相关细胞和因子在SCR多孔载体的表面和内部富集效应,探讨SCR过程中成骨相关成分富集和富集后复合物促进成骨的潜在机制,为进一步研究与开发术中即刻构建新型组织工程骨修复材料提供理论基础和技术支持。方法1. DBM-LBL-rFN/CDH制备及体外检测:通过聚乙烯亚胺提供初始电荷,以壳聚糖为阳离子,rFN/CDH为阴离子,层层自组装构建多层rFN/CDH融合蛋白修饰界面。通过接触角检测观察支架材料表面化学成分改变确定修饰方案;通过X线光电子能谱(XPS)分析修饰前后材料表面元素组成变化;通过扫描电镜观察支架材料表面形态及孔径变化;液体位移法检测材料孔隙率变化;rFN/CDH融合蛋白免疫荧光观察蛋白在支架材料表面分布情况,震荡漂洗实验检测支架材料稳定性;将人骨髓间充质干细胞(human bone marrow stem cells,hBMSCs)接种至支架材料表面,计算接种细胞上架率,连续培养3天、7天后,细胞骨架染色、CCK-8法观察细胞在支架材料表面增殖情况;接种细胞后成骨诱导培养,Western Blot检测骨钙素(osteocalcin)、骨桥蛋白(osteoponin )等成骨标记表达情况。2. DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集效率及其对BMSCs迁移、增殖和成骨分化的影响:SCR构建DBM-LBL-rFN/CDH富集骨髓组织工程骨,流式细胞术检测SCR过程中材料富集的细胞组成,蛋白质芯片和ELISA检测富集材料中成骨相关细胞因子水平;提取富集后支架材料总蛋白制备细胞迁移条件培养基、细胞增殖条件培养基、成骨分化条件培养基。以细胞迁移条件培养基构建hBMSCs体外迁移trans-well模型,检测支架材料富集的细胞及因子对hBMSCs迁移的影响;以细胞增殖条件培养基培养hBMSCs,CCK-8法检测富集材料细胞增殖的影响;以成骨诱导条件培养基诱导hBMSCs成骨分化,RT-PCR、WB 检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、OCN、OPN 等成骨标记表达情况,评价富集材料富集的细胞及因子对hBMSCs成骨分化的影响。3. DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集材料体内成骨效应及其募集宿主细胞参与成骨效应研究:用DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集材料修复FVB/N小鼠股骨缺损模型,术后4周,Micro-CT、HE染色及masson染色评价成骨情况,扭转实验和三点弯曲实验评价骨缺损修复后生物力学强度;术后通过尾静脉注射绿色荧光蛋白标记的小鼠骨髓间充质干细胞(mouse BMSCs,mBMSCs),术后3天取植骨区标本,ELISA检测植骨区SDF-1α浓度,免疫荧光检测富集后组织工程骨募集BMSCs的能力。结果:1.材料修饰8层后随着修饰层数增加,接触角呈规律的波动在34° (rFN/CDH)至45° (Chi)之间,提示材料表面组成已趋于稳定,为确保修饰界面在SCR及植入体内后持续发挥作用,我们将修饰12层的界面(即PEI-rFN/CDH- (Chi-rFN/CDH) 5)确认为最终修饰方案,并以LBL-rFN/CDH指代;XPS检测表面元素组成结果提示,DBM表面主要为碳元素(90.48±0.19%),当修饰材料最外层为Chi时表面碳、氮、氧元素含量分别为 51.63±0.64%、15.42±0.2%、32.31±0.35%,而最外层为 rFN/CDH 时,分别为45.91±0.61%、18.47±0.29%、34.40±0.19%,支架材料表面元素组成随修饰过程明显改变;DBM支架材料表面光滑,修饰后的支架材料表面形成大量不规则凸起,材料孔隙内部形成新的小孔,平均孔径由463±110 μm下降至246±87μm; DBM-LBL-rFN/CDH孔隙率为0.620±0.152,与DBM (0.660±0.153)无明显差异;免疫荧光结果发现强力震荡漂洗前后DBM-LBL-rFN/CDH材料表面蛋白含量均明显多于单纯浸泡的DBM-rFN/CDH支架材料,提示材料修饰高效且稳定;修饰后的支架材料接种hBMSCs细胞上架率71.2±5.9%,显著高于DBM组(54.0±3.7%),具有更强的粘附性;接种BMSCs培养3天和7天后,细胞骨架染色和CCK-8检测提示DBM-LBL-rFN/CDH支架材料表面显著多于DBM组,表明LBL-rFN/CDH可促进MSCs增殖;成骨诱导培养后,DBM-LBL-rFN/CDH组细胞OCN、OPN等表达明显强于DBM组,表明LBL-rFN/CDH可提供良好的促成骨微环境。2. DBM-LBL-rFN/CDH支架材料有核细胞富集率和富集倍数(29.35±1.69%、2.80±0.16)显著高于DBM组(18.55±1.47%和1.69±0.13),封闭骨髓细胞表面识别RGD序列的整合素后,富集率和富集倍数下降至23.70±1.87%和2.29±0.18;DBM-LBL-rFN/CDH富集的有核细胞中,识别RGD的整合素(α3和αV)阳性细胞比例为 60.51±4.11%和 32.72±3.89%,明显高于 DBM 组(48.13±2.89% 和 21.89±2.26%),封闭整合素后,该比例下降至(49.97±5.04%和25.38±2.42%);成骨相关的BMSCs、造血干细胞、单核细胞变化趋势也与此相类似。细胞因子芯片和ELISA检测结果提示富集骨髓后 DBM-LBL-rFN/CDH 支架材料中 CXCL3、IFN-γ、bFGF、BMP-2、BMP-6、MDC、SDF-1α、PDGF-BB等成骨相关因子明显多于DBM组和DBM/SAP组。DBM-LBL-rFN/CDH富集后材料蛋白提取物较DBM组和DBM/SAP组具有更强的促进细胞迁移、增殖和成骨分化的能力。3.绿色荧光蛋白特异性免疫荧光和小动物成像结果均证实DBM-LBL-rFN/CDH植入体内后可募集更多的尾静脉注射的mBMSCs,同时材料局部SDF-1α浓度明显高于DBM组和DBM/SAP组,提示富集骨髓的DBM-LBL-rFN/CDH复合物可募集宿主细胞促进骨修复。影像学检查、生物力学测试、HE和Masson染色均证实修复临界骨缺损具有明显优势。结论通过层层自组装技术可构建稳定的LBL-rFN/CDH多层融合蛋白修饰界面修饰DBM支架材料。修饰支架材料对骨髓中BMSCs、HSCs、单核细胞及成骨相关细胞因子均具有良好的富集效应。DBM-LBL-rFN/CDH富集骨髓组织工程骨可形成良好的微环境募集MSCs并促进其增殖和成骨分化,显著促进骨愈合。DBM-LBL-rFN/CDH富集骨髓组织工程骨是一种良好的自体骨替代材料。