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海因酶是一种重要的工业用酶,可用于药物中间体和食品添加剂等产品的制备,对其开展新酶挖掘和性质研究具有重要意义。D-对羟基苯甘氨酸(DHPG)是一种重要的医药中间体和工业原料,在工业生产中可利用D,L-对羟基苯海因为底物,经D.海因酶和D.氨甲酰水解酶两步酶法催化制备。其中海因酶作为酶法生产DHPG的起始酶,受到研究者的广泛关注。
为了寻找性质优良的海因酶,以实验室前期分离得到的来源于皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkhiolderia pickettii)的工业用海因酶HYDBp的氨基酸序列作为查询序列,采用BlastP在NCBI数据库中进行同源搜索,得到一系列可能具有海因酶活性的候选蛋白。通过对这些蛋白的编码基因进行克隆、表达及酶活力测定,发现了一种来源于海洋菌dannaschia sp.CCS1的新海因酶,将之命名为HYDJ。该酶的比活力是HYDBp的4倍,具有工业应用的潜力。对HYDJs的酶学性质分析表明,其反应最适温度为50。C,最适pH为7.6。与HYDBp相比,HYDjs明显较高,而其‰则相当。
进一步研究了对HYDjs活力有影响的关键位点,特别是底物结合口袋附近的氨基酸残基。以来源于Dictyostelium discoideum的二氢嘧啶酶HYDDd的晶体结构为模板,对HYDjs进行了同源模建。通过将底物与同源模型进行分子对接分析,发现三个氨基酸残基位点Phe63、Leu92和Phe150参与了底物的结合,推测与HYDjs的活力密切相关。在此基础上,对这三个位点进行了饱和突变分析,结果表明,这些位点氨基酸残基的疏水性是HYDJS维持催化活力的关键因素。将Phe63突变为带电残基会使HYDjs的酶活丧失, Leu92突变为非疏水残基或小侧链疏水残基亦会使酶活大大降低,而Phe150则更加保守,当将其替换为其它任何氨基酸残基均会使酶活大幅度降低。
酶的可溶性表达是其结构研究的必备条件。HYDJS在大肠杆菌中过表达会导致包涵体的形成,限制了其后续研究和应用。为了解决这一问题,采用分子伴侣共表达的策略。将三套分子伴侣系统GroES-GroEL(GroESL)、DnaK-DnaJ-G-rpE(DnaKJE)和trigger factor(TF)分别与HYDj。共表达。结果显示,GroESL能够显著增强HYDJS的可溶性表达,使其发酵液酶活力比原始重组菌提高了3倍。
为了进一步探究HYDJs高比活的分子机制,对其进行了晶体结构解析。在pH7.6、8%-10% PEG4000存在的条件下,得到了HYDjs晶体。应用X-射线衍射对该晶体进行了解析,获得分辨率为2.2 A的HYDjs晶体结构。该结构与二氢嘧啶酶家族中其它酶类似,均含一个由(a/B)8组成的TIM桶状结构域和一个由B片层构成的三明治结构域。位于TIM桶状结构域的六个保守氨基酸及两个水分子以配位键的形式稳定两个金属离子,从而构成HYDj。的活性中心。与目前多数已知结构的海因酶及二氢嘧啶酶不同的是,HYDjs单体的C端有一个较长的延伸片段,以domain swapping形式与相邻的亚基形成相互作用,参与HYDJS的二聚化进而形成四聚体。HYDJS的底物结合口袋与HYDBp相比更加松散,对底物的空间位阻较小,可能是其具有较高比活的原因。通过与Saccharomyces kluyveri来源的二氢嘧啶酶HYDsk的晶体结构比较,推测HYDjs水解五元环底物的机制可能与HYDsk水解六元环底物的类似,但产物的结合和释放的机制或许有所不同。