论文部分内容阅读
Ⅱ．1．1目的与方法 临床流行病学研究表明非甾体类抗炎药（NSAIDs）可以降低消化系肿瘤的发病率，其机制被认为与环氧合酶-2（COX-2）抑制有关。已发现COX-2在多种上皮性肿瘤内表达增加，但其在河南高发区食管癌组织的表达如何、受何种因素调节和控制、在食管上皮恶性转化过程中如何起作用、以及在肿瘤化疗中的意义如何，均尚未明了。本研究通过免疫组化检测，探讨食管癌组织COX-2表达与细胞分化及淋巴结转移的关系；结合原代细胞培养、Western Blotting和RT-PCR技术，分析血清对食管癌细胞株COX-2表达的影响，探讨TGF-β1与成纤维细胞的相互作用对COX-2表达的调控以及TGF-β受体在其中的地位；通过人乳头状瘤病毒-16-E6E7基因和端粒酶催化亚单位hTERT转染，建立食管上皮永生化模型，研究COX-2表达在此过程中的作用；配合流式细胞技术，探讨丝裂霉素C化疗对食管癌COX-2的表达及其影响。 Ⅱ．1．2主要结果与结论 Ⅱ．1．2．1食管癌组织中COX-2的表达及其意义 COX-2免疫阳性反应出现于51.6％（16／30）的食管癌组织，正常对照组织阴性；组织恶性分化程度与COX-2免疫反应的强度呈负相关（r=-0.564；P=0.001）；伴淋巴结转移者61.9％COX-2阳性（13／21），但COX-2的免疫反应程度与淋巴结转移无关（K-S Z=0.830；P=0.496），提示COX-2过度表达可能与食管癌细胞分化程度有关，可能成为食管癌防治，特别是高分化食管癌治疗的新靶点。 Ⅱ．1．2．2血清浓度对不同食管癌细胞株COX-2表达和细胞生长的影响 Western Blotting检测发现，TGF-βⅠ、Ⅱ受体在原代培养的正常食管上皮细郑州大学博士学位论文2003届胞和EC一18细胞中均有表达，ECa-109细胞只存在痕迹量的I型受体表达而n型受体表达缺失。梯度浓度血清培养48小时后，在TGF一p受体功能缺失的ECa一109细胞中，COX一2 n1RNA和蛋白质的表达均呈现浓度依赖性，而同时存在TGF-pl、n受体表达的EC一18细胞，COX一2 mRNA和蛋白质的表达分别在血清10%组和2.5%组出现高峰（P<0.05），提示TGF一p;可能是血清中抑制cox一2表达的因素，但MTT检测示食管癌细胞株ECa-109和EC一18均在O一10%的胎牛血清浓度下表现出血清浓度依赖性生长趋势，提示COX-2表达水平的改变并非体外培养条件下影响细胞增殖的决定性因素。对TGF一p受体表达形式不同的食管癌细胞，不同血清浓度对COX一2表达影响不同，这一作用应列为体外培养条件下肿瘤细胞COX一2研究不可忽视的重要影响因素之一。n.1.2.3 TGF一pl与成纤维细胞的相互作用影响食管癌细胞COX-2表达 原代培养获得的成纤维细胞，一组加含10%FcS培养基、另一组另加5呵mL的TGF一pl，分别培养24小时，收集上清，即为FS液及FSTB液。生长良好的食管鳞癌细胞株EC卜109、EC一18分别设TGF一pl组、FS组和FSTB组，分别以加入5呵mL TGF一pl的10%Fcs新鲜培养基、FS液及FsTB液完全换液，继续培养24小时。结果发现，加入TGF一pl后，同时存在TGF一pl、n受体表达的EC一18细胞中COX一2蛋白表达降至原来的0.103倍;加入FS液组上升2.368倍，FSTB组上升2.793倍;TGF一pl组、FS组和FSTB组COX-2 mRNA表达量呈现相同趋势（均尸<0.05）。在TGF一p受体功能缺陷的ECa一109细胞，TGF一p，组和FS组cox-2蛋白的表达与10%FCs组无显著性差异护一0.87，尸一0.806)，而FSTB组则明显升高2.292倍（P<0.05）;COx-2 mRNA表达在TGF一p;组与10%FCS组差别无显著性（P一0.903），而FS组和FsTB组分别为10%FCS组的1.959倍和2.531倍（均尸<0.05）。研究提示，TGF一pl可调节COX一2表达，且其作用受TGF一p受体表达类型的影响，TGF一p;可使成纤维细胞产生刺激食管癌细胞COX一2表达的物质，且至少在转录水平发挥作用。TGF一p;可以通过刺激成纤维细胞转而上调COX一2表达，并可能因此影响食管癌的发生与发展。将COX-2表达用于食管癌细胞分化与预后关系研究时，应考虑高分化癌组织中较多成纤维细胞的影响。n.1.2.4食管上皮细胞的永生化与COX一2表达调控原代培养获得纯化食管上皮细胞NEC凡，通过基因转染，获得表达hTERT全文摘要和/或1于V-16一E6E7的永生化食管上皮细胞。10%FCS存在条件下，NEC凡和食管癌细胞均表达COX一2 mRNA与蛋白质，血清饥饿24hrs后，NEC凡细胞几乎不能测得COX一2表达，食管癌细胞较含血清时表达稍弱，但仍明显强于NEC凡，提示同等条件的血清刺激不会掩盖正常细胞与永生细胞间COX一2表达的差异;在NEC凡、NEC凡一E6E:及NEC戊一E正7一hTERT细胞中，仅NEC凡一民 E7一hTERT表达hTERT mRNA，提示HPv-16一氏E:转染可通过独立于端粒酶的方式引起NEC凡细胞永生化;从NEC凡到NEC凡一E6E:再到NEC凡一E6E7一hTERT，COX一2及Id一1蛋白的表达水平逐渐升高（P<0.05），Cox一2与Id一1蛋白质水平的表达改变相关（r一0.994，p一0.035），mRNA水平也呈相应改变，但无统计学意义（P>0.05），提示转染HPV- 16一E6E:可上调食管上皮的COX一2表达，并因端粒酶活性的激活进一步上升，食管上皮永生化过程中Id-1与COX一2表达的改变高度一致，提示COX