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α-L-鼠李糖苷酶催化末端含α-L-鼠李糖的天然产物,该酶广泛分布于自然界,细菌、真菌、酵母、动植物体内均有报道,工业应用范围广,是生物技术应用重要的一类酶。本研究首先基于目标底物芦丁与其苷元槲皮素的紫外-可见光谱差异,利用双波长检测建立全新的高通量筛选方法,随后利用半理性设计策略,集中于广义酸基序进行定点饱和突变和定点突变,旨在最终获得水解芦丁的高活性α-L-鼠李糖苷酶突变体,并研究其突变体酶学性质,同时也探索了利用微波辅助乙醇萃取法探索从苦荞叶和苦荞茶中获得高纯度、高浓度天然芦丁提取液。本实验室前期通过检索CAZy数据库,以多形拟杆菌VPI-5482全基因组为模板成功扩增获得目的基因BtRha78A,连接至载体pET-28a,对酶学性质进行表征,与同源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶三级结构和序列进行比对,经丙氨酸扫描突变验证,确定BtRha78A催化关键残基,对其广义酸基序研究显示,基序中一部分残基为非催化功能残基。在酸性,甲醇和碱性中测定黄酮化合物芦丁、异槲皮素与槲皮素0 min及孵育30min后250-500 nm吸收值,芦丁在400 nm具有特征峰,槲皮素在320 nm有特征峰。基于此特性,准备在α-L-鼠李糖苷酶基础上联合β-D-葡萄糖苷酶将芦丁直接转化为槲皮素,建立双波长高通量筛选方法,经POE-PCR成功扩增得到高活性β-D-葡萄糖苷酶(TnBgl1A-DM),纯化获得目的蛋白。BtRha78A随酶浓度(0-80μg/mL)和反应时间(0-120 min)改变,其相应320 nm和400 nm吸收值改变,确定了此双波长筛选方法可行性。实验室9株α-L-鼠李糖苷酶进行活性筛选,用α-L-鼠李糖苷酶全细胞结合双波长筛选方法获得水解芦丁相对活性,为高通量筛选奠定基础。经实验室前期研究结合半理性设计思维,确定构建BtRha78A-V338饱和突变库,96孔板初筛,复筛和终筛,得到一株活性提升20%的突变体V338S。丙氨酸扫描突变技术将BtRha78A广义酸基序残基进行突变,利用全质粒PCR对广义酸基序序列比对残基进行突变体,突变体经双波长筛选法初筛得到4个高活性突变体V338A、V338I、S340A和G341A,HPLC复筛,结论与初筛一致。对催化活性提升较高的突变体V338A、V388I、V338S、S340A和WT进行生物转化芦丁酶学性质及全细胞性质研究,得到酶反应时间曲线,5个酶反应180 min到平台期,V338S反应240 min转化率为98%,WT反应240 min转化率为86%。酶动力学常数研究表明V338A和V388S各项常数均优于WT,V388I和S340A酶动力学常数差于WT。全细胞反应时间曲线显示5个突变体全细胞反应到4.5 h即到平台期,WT全细胞反应4.5 h转化率为73.9%,而V338S全细胞反应4.5 h转化率即达100%。全细胞可循环利用次数表明V338S前4次使用较稳定,WT前3次使用较稳定。为从廉价原材料中获得天然黄酮糖苷芦丁,用微波辅助有机溶剂萃取法,考察料液比和乙醇浓度对苦荞叶和苦荞籽中芦丁提取的影响。苦荞籽提取最优条件:乙醇浓度为55%,料液比为1:20。苦荞叶提取最优条件:乙醇浓度为65%,料液比1:40。