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猴B病毒(Monkey B Virus)属于α-疱疹病毒亚科,单纯疱疹病毒属成员,是一种以猴(特别是猕猴属)为自然宿主的动物源性病原体。猴B病毒在其自然宿主中的感染率大于60%,但多呈隐性感染。该病毒感染非自然宿主(人和其他动物)的致死性强,感染病例的病死率超过80%,即使幸存也会留下失语、瘫痪等严重的神经后遗症。流行病学调查显示,猴B病毒主要以接触感染为主,被感染猴抓伤、咬伤都有可能感染猴B病毒,也有人传入和虫媒传播等报道。灵长类的人和猴感染猴B病毒后,一旦出现临床表现,表明病毒已侵入神经系统,治疗便失去了意义。因此,建立快速鉴别诊断的方法,对猴B病毒早期的诊断与治疗有重要意义。由于猴B病毒与在脊椎动物(包括人类)中广泛感染的其他α-疱疹病毒(特别是人单纯疱疹病毒,HSV)高度同源,表现出较强的交叉反应,因此,这类疱疹病毒成为了现阶段猴B病毒快速鉴别诊断的主要障碍。由于受HSV和猴B病毒的感染特点等因素影响,目前所建立的猴B病毒检测方法都达不到快速、特异之目的。临床医学中常用狒狒疱疹病毒4(Herpes virus papio2, HVP-2)、猴因子8(simian agent8, SA8)和HSV等病毒蛋白作诊断抗原检测猴B病毒,但其检测的灵敏度低。也有人研制了猴B病毒灭活疫苗,但该疫苗保护率低于50%。近年来,随着对猴B病毒结构研究的不断深入,特别是猴B病毒的全基因组测序的完成,囊膜糖蛋白(glycoprotein)逐渐成为猴B病毒诊断和防治研究的主要靶点。糖蛋白D和B是灵长类动物受到α-疱疹病毒感染后免疫应答的主要标靶,gD和gB的抗体最先出现在急性或再发性人类HSV感染的血清中,并且达到很高效价,也可以保持2年之久。gB是导致灵长类疱疹病毒之间广泛抗原交叉反应的主要原因,而gD中的氨基酸序列相对保守,推断猴B病毒gD蛋白可以刺激机体产生特异性抗体。鉴于猴B病毒囊膜糖蛋白在鉴别诊断过程中的重要作用,本试验从以下方面展开工作：(1)比较猴B病毒与HSV-1和HSV-2三种囊膜糖蛋白gB、gC和gD的同源性差异,分析猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因序列；(2)从中国源恒河猴B病毒的感染组织中克隆gD胞外区基因,分析其序列特征；(3)对目的基因——猴B病毒gD基因进行原核表达；(4)以纯化后的重组gD蛋白为包被抗原,建立检测猴B病毒抗体的间接ELISA法。1.猴B病毒囊膜糖蛋白生物信息学分析采用DNAMAN软件比较猴B病毒、HSV-1和HSV-23种α-疱疹病毒中囊膜糖蛋白(gB、gC和gD)的同源性差异,发现猴B病毒囊膜糖蛋白gB与HSV-1、HSV-21(?)的同源性为78%、77%,gC与HSV-1、HSV-2的同源性为42%、48%,gD与HSV-1、HSV-2的同源性为56%、58%。有研究表明gB是导致灵长类疱疹病毒之间广泛抗原交叉反应的主要原因,而gD中的氨基酸序列却更加保守。本实验室研究人员前期获得了重组表达的猴B病毒囊膜糖蛋白gC并建立了gC-ELISA检测方法,gC-ELISA(?)的灵敏度和特异度分别为94.1%和100%。因此,本试验以猴B病毒囊膜糖蛋白gD作为研究对象。利用生物信息学方法对猴B病毒囊膜糖蛋白gD结构、亲水性、表面可及性、抗原性指数、柔韧性以及B细胞表位等参数进行分析和预测,结果显示：该蛋白的信号肽位于N端l-24氨基酸,胞外区位于N端25-341氨基酸,跨膜区位于N端342-364氨基酸,胞内区位于N端365-394氨基酸；蛋白分子的柔性结构区域分布均匀,亲水性较好,表面可及性较高；区段24～44、49～60、49～76、107～118、141～150、164～174、206～214、287～308、322～339和365～382的平均性抗原指数分别为0.983、1.854、0.901、1.763、1.62、1.1、2.028、0.979、0.676和1.148,提示B细胞抗原表位在这些区段的可能性较大。本试验最终选择猴B病毒囊膜糖蛋白gD的胞外区作为筛选高效表达的抗原候选片段。2.猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因克隆及特征分析根据NCBI公布的猴B病毒标准株E2490的全基因序列,以猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因胞外区为目的片段,利用BioXM2.6软件分析该序列的酶切位点,发现该序列存在包括SmaⅠ、SacⅡ等在内的203个常见酶,而NdeⅠ、HindⅢ等58个酶在该序列中未曾发现,最终选择NdeⅠ、HindⅢ为酶切位点,设计特异性引物,PCR扩增目的基因并将其克隆到pGM-T载体中,经PCR和酶切鉴定后测序。PCR扩增得到约1000bpl的目的基因,进一步分析目的基因序列发现,扩增基因片段的核营酸序列与猴B病毒标准株E2490的同源性为97.21%,GC含量为75%,呈区域集中分布,序列中含有20个稀有密码子,占5.99%。比较猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的同源性,发现该基因与BV-MC1gD gene的同源性最高为98.6%,与HSV-1gD gene(?)同源性最低为61.7%。根据猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的同源性比对结果,下载与猴B病毒不同分离株及同源性较高的其它α-疱疹病毒相应的核苷酸序列,用DNAStar进行系统进化树分析,发现猴B病毒囊膜糖蛋白gD与BV-MC1gD gene亲缘关系最接近,与HSV-2333gD gene(?)的亲缘关系最远。3.猴B病毒囊膜糖蛋白gD的重组表达以猴B病毒全基因组为模板,通过PCR扩增获得目的基因,经PCR、酶切及测序鉴定后插入原核表达载体pET-28b(+)中,构建了重组表达质粒pET-28b(+)-gD。将重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,最终获得48Ku以包涵体形式表达的gD重组蛋白,表达蛋白约占菌体总蛋白的35%左右。采用AKTA蛋白纯化系统纯化目的蛋白,得到浓度为1.6mg/mL、纯度为94.8%(灰度扫描结果)的重组蛋白,经透析除去其中的尿素和咪唑。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳,以BIO-RAD半干转移系统转膜(PVDF)。表达产物的Western blot结果表明重组gD蛋白能与猴B病毒阳性血清和抗His单克隆抗体特异结合,具有良好的免疫原性,可作为猴B病毒血清学检测的候选抗原。4.猴B病毒囊糖膜蛋白gD-ELISA法的建立基于重组gD蛋白为包被抗原,建立检测猴B病毒抗体的间接gD-ELISA (?)去。gD-ELISA的最佳工作条件为：抗原浓度为2μg/mL,血清稀释度为1：8,封闭液为含8%兔血清的PBS,兔抗猴IgG-HRP的稀释比例为1：25000,37℃避光显色12min；阳性临界值为OD450nm≥0.166。本试验建立的gD-ELISA法特异性良好,能有效区分BV与HSV。应用gD-ELISA与同室上代平建立的gC-ELISA和“金标准”——斑点免疫结合技术方法(DIA,美国VRL实验室)分别对来自北京、四川的166份(北京90份,四川76份)猴血清样本进行检测,三者的阳性率分别为12.65%、13.25%和12.05%,其中北京90份猴血清样本检出的阳性率分别是13.33%(12/90)、13.33%(12/90)和12.22%(11/90),四川76份样本检出的阳性率分别是11.84%(9/76)、13.16%(10/76)和11.84%(9/76)。将gD-ELISA与“金标准”方法DIA进行筛检试验评价,筛检试验的真实性评价结果是gD-ELISA的灵敏度和特异度分别为95%和97.26%,其约登指数为0.9226,表明本次建立的猴B病毒gD-ELISA与猴B病毒“金标准”DIA方法的符合程度较高。筛检试验可靠性评价结果是观察一致率Po为98.19%,机遇一致率Pe为78.35%,Kappa值为0.92,表明gD-ELISA与猴B病毒“金标准”DIA方法的一致性较好。