【摘 要】
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脂肪酶在非水相中催化的酯化反应具有重要的工业应用。天然脂肪酶的非水相酯合成活性普遍较低,研究如何提高脂肪酶的非水相催化活性具有重要的理论和实际应用价值。来源于丝
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脂肪酶在非水相中催化的酯化反应具有重要的工业应用。天然脂肪酶的非水相酯合成活性普遍较低,研究如何提高脂肪酶的非水相催化活性具有重要的理论和实际应用价值。来源于丝状真菌华根霉的脂肪酶具有较高的酯合成活性,但是异源表达的华根霉脂肪酶未表现出酯合成活性。本研究以异源表达的华根霉前导肽脂肪酶(r27RCL)和成熟肽脂肪酶(mRCL)为研究对象,分别通过不同方法对酶蛋白进行处理,提高重组脂肪酶的酯合成活性,为工业应用奠定基础。主要研究内容和结果包括:(1)针对异源表达的商品化华根霉前导肽脂肪酶r27RCL,研究表面活性剂等处理条件对脂肪酶酯合成活性的激活效果,提高r27RCL的催化活性。结果表明,不同表面活性剂对脂肪酶的作用效果明显不同,其中n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)可有效提高r27RCL酯合成活性。DDM对r27RCL的激活效果取决于二者的摩尔比,而非单纯的表面活性剂浓度。当DDM与r27RCL的摩尔比值大于30后,随着DDM添加量增加,r27RCL的酯合成活性不断提高。pH和无机盐会对DDM对r27RCL的激活效果有一定的影响。其中,改变磷酸盐浓度可以强化DDM对r27RCL酯合成活性的激活效果,最适条件下比活力进一步提高96%。(2)针对由E.coli表达的华根霉成熟肽脂肪酶mRCL包涵体蛋白,研究变性、复性以及添加表面活性剂对脂肪酶酯合成活性的影响。由于mRCL在E.coli中表达主要形成包涵体,在表达条件优化,提高mRCL包涵体表达水平的基础上,进行蛋白变性、复性处理。在初始蛋白浓度100μg·mL-1,复性温度4℃,pH 8.0条件下,结合梯度降低尿素浓度进行透析复性,可溶性蛋白回收率可达72%,但复性得到的mRCL并不表现出明显的酯合成活性。在复性过程中添加表面活性剂DDM可以将mRCL酯合成活性提高32倍。(3)将酯合成活性得到显著提高的脂肪酶应用于其它非水相催化反应。DDM和无机盐激活的r27RCL在有机溶剂和无溶剂体系中分别催化生物香料己酸乙酯和生物柴油油酸乙酯的合成,初始反应速率和转化率均得到显著提高,该结果验证了该酶制剂在催化非水相酯合成反应中的有效性和适用性。
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