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氯霉素是第一个人工合成的广谱抗生素,因其效高价廉,在我国畜牧业中得到广泛应用,对畜禽疾病的控制和治疗起到了重要的作用。随着氯霉素的广泛应用及研究的深入,发现其有许多毒、副作用,因此,必须控制氯霉素在动物性食品中的残留,保障消费者健康与安全。 本文分两部分,第一部分将氯霉素（CAP,Chloramphenicol）与牛血清白蛋白(（BSA）、卵清白蛋白（OVA）利用优化的重氮化法、混合酸酐法、碳化二亚胺法进行偶联及鉴定,分别作为免疫抗原及包被抗原,免疫抗原注射免疫新西兰大白兔获得多抗血清。第二部分建立了快速检测氯霉素的间接竞争ELISA方法,并通过实验,对检测过程中的各项条件进行优化。 分别应用重氮化法、混合酸酐法、碳化二亚胺法将CAP与载体蛋白BSA偶联制备人工合成抗原,以此作为免疫抗原,同法合成包被抗原。它们的紫外扫描光谱、SDS-PAGE电泳、动物免疫试验均表明偶联成功。免疫2-3月龄新西兰大白兔,获得多抗CAP抗血清,用间接非竞争ELISA法测定抗血清效价。数据显示,混合酸酐法在合成氯霉素人工抗原方面较优于其他两种方法。本试验用过碘酸钠改良法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体,用辛酸—硫酸铵法、Sephadex-G-25、DEAE离子交换提纯纯化血清IgG,经计算结合物中各项指标,表明酶标抗体标记成功,并且通过SDS-PAGE电泳和直接ELISA测定也可得出酶标抗体标记成功。 采用混合酸酐法制得的免疫抗原免疫兔子得到的抗血清进行间接竞争ELISA实验,优化ELISA工作条件,建立了间接竞争ELISA检测CAP方法。方阵滴定法确定理想OVA-HS-HSA包被抗原的浓度为1.25μg/mL,酶标二抗（羊抗兔IgG-HRP）工作浓度为1:400以及多抗（SM2-PcAb）血清的工作浓度为1:12800。以上述实验条件为基础,以系列稀释的CAP标准溶液作为检测对象,绘制标准曲线,得到的线性回归直线方程为y=1.069—0.2633x,相关系数R2=0.9867,从标准曲线可以得知,此方法可测定的最适范围为10ng/mL～200ng/mL,最小检测限约为0.001pg/mL。 本实验所建立的ELISA方法的精确度以批内误差（孔间差异）和批间误差（板间差异）表示,结果表明孔间差异和板间平均差异分别为4.24%和9.20%,这表明方法精确度较好。添加回收率实验测得氯霉素对鸡肉样本在10～100ng/mL范围内的平均回收率为94.86%±9.55%。在可测定浓度范围内,氯霉素（CAP）抗血清与磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine）、恩诺沙星（Enrofloxacin）、硫酸链霉素（Streptomycin）、青霉素（Penicillin）、氟哌酸（诺氟沙星Norfloxacin）等可能会因同时使用而导致共同残留的抗生素药物未显示免疫交叉反应性,与结构相似物氯霉素琥珀酸盐的交叉反应率CR50为572,这表明所建立的方法有较高特异性和选择性,适合氯霉素药物残留样本快速检测。为开发具有自主知识产权的氯霉素试剂盒打下了良好的基础。