论文部分内容阅读
家蚕在中国有悠久的养殖历史,它不仅拥有较高的经济价值,还能作为良好的模式生物拥有较高的科研价值。但是在家蚕的养殖过程中,家蚕容易受到多种因素的影响而造成损失。在我国,由家蚕核型多角体病毒(BmNPV)引起的病毒病占整个病毒病的很大部分,会对家蚕造成极大的危害。家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)是二分DNA病毒科中第一个被发现的成员,具有典型性。通过荧光定量PCR方法,研究家蚕抗BmBDV品系798和感性品系306接种Bm BDV、抗BmNPV品系NB和感性品系华八(三五)接种BmNPV后一些免疫相关基因(bmi、argo、dicer、cap1、cap3和car)在家蚕中肠组织中的转录水平变化情况。结果发现,虽然这些基因的转录水平在不同家蚕品系中差异很大,Bm BDV和BmNPV的感染对基因转录水平的影响也有所不同,但存在一个共同的趋势,即病毒感染能够负调控这些基因的转录水平。在相应病毒感染情况下,bmi和dicer在798和306中下调,在NB和华八(三五)中上调;argo和cap3在798和306中上调,在NB中上调,但在华八(三五)中下调;cap1在798和306中上调,在NB和华八(三五)中也上调;car在798中没有明显变化,在306中下调,在NB中上调,在华八(三五)中下调。这些发现为进一步研究这些基因在病毒感染增殖中的作用打下了良好的基础。car基因是一个羧酸酯酶基因。以家蚕cDNA作为模版,利用PCR技术对car基因进行了克隆。将克隆得到的基因片段与克隆质粒相连进行扩增,将扩增后的片段与表达质粒相连并转入BL21中,经IPTG诱导表达目的蛋白,目的蛋白主要以包涵体方式存在,将目的蛋白变性后利用Ni-NTA对其纯化。将经纯化的蛋白分为两部分,一部分用作制备多克隆抗体,将另一部分复性来用作酶活测定。经过4周对小鼠的免疫之后,成功地制备了多克隆抗体血清。经酶活测定,发现在39℃时目的蛋白的酶活最高。利用荧光定量PCR的方法研究了car基因在家蚕不同生长阶段和组织中的转录水平。经实验发现,脂肪体中car基因的转录水平比其他所有组织中最高的都高,而在头中的转录水平是最低的;car基因在蛹期的转录水平比其他生长阶段都高。