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支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞和细胞组分)参与的气道慢性炎症性疾病。其中,Th1和Th2淋巴细胞亚群数目和(或)功能失衡,以及Th1/Th2比例失调,在哮喘发病中起重要作用;而Treg细胞能以“主动”方式来维持机体的免疫平衡;纠正这种失衡的免疫学反应是控制哮喘发作的一个重要研究方向。几丁质微粒(CMP)是指直径1~20μm几丁质颗粒,研究显示它可降低哮喘小鼠气道炎症,增加IFN-γ的表达。目前研究发现,酸性哺乳动物几丁质酶(AMCase)的表达与支气管哮喘密切相关,能有效影响TH2炎症因子表达,但其不影响IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ以及STAT-6的表达。由于动物研究显示几丁质酶常在致敏原刺激7天后明显表达,提示几丁质酶与气道重塑可能有关,AMCase在支气管哮喘病理生理机制中起到不可忽略的作用。已知,哺乳动物体内不存在几丁质合成酶,但酸性哺乳动物几丁质酶的发现,有理由引起研究者对几丁质和酸性哺乳动物几丁质酶对哺乳动物作用相互关系的兴趣;两者对支气管哮喘病理生理机制如何影响?以及如何相互影响?有待进一步研究。第一部分几丁质微粒对支气管哮喘小鼠TH2型趋化因子、TGF-β1、AMCase表达的影响目的观察几丁质微粒对支气管哮喘小鼠气道炎症、TH2型趋化因子及TGF-β1、AMCase表达的影响。方法BALB/C小鼠分为四组,分别为哮喘组、对照组、经口几丁质组、经鼻几丁质组。哮喘组、两几丁质干预组(CMP 40μg)经卵清蛋白致敏14天后,最后一次OVA雾化结束后24h,收集BALF进行细胞计数和分类,测定BALF中IL-10和TGF-β1;流式细胞检测Th1、Th2、Treg比例;H-E染色观察肺组织炎症改变;用免疫组化方法检测肺组织TGF-β1的表达;原位杂交方法检测肺组织AMCase mRNA;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量测定肺组织内TGF-β1、AMCase、TARC、MDC、NF-κB、STAT1和C-jun mRNA表达。结果各几丁质组较哮喘组小鼠气道炎症明显减轻,BALF嗜酸性粒细胞数量明显减少。几丁质组Th1淋巴细胞比例较哮喘组明显增高,TGF-β1的表达、小鼠肺组织AMCase、STAT1mRNA的表达明显降低。经鼻几丁质组TARC mRNA的表达较哮喘组和对照组明显增高,有显著统计学差异(P<0.05)。经口几丁质组MDCmRNA表达较哮喘组明显增高,但经鼻几丁质组MDC mRNA的表达较哮喘组明显减低。经口几丁质组NF-κB、C-jun mRNA的表达较哮喘组明显增高。结论几丁质微粒可通过提高Th1细胞比例在一定程度上减轻哮喘小鼠的气道炎症,降低肺组织TGF-β1、STAT1和AMCase mRNA的表达。几丁质微粒可促进肺组织TARC、NF-κB、C-jun mRNA的表达。第二部分几丁质酶抑制剂对支气管哮喘小鼠TH2型趋化因子、TGF-β1表达的影响目的观察几丁质酶抑制剂对支气管哮喘小鼠气道炎症、TH2型趋化因子及TGF-β1表达的影响。方法BALB/C小鼠分为三组,分别为哮喘组、对照组和抑制剂组。哮喘组、抑制剂组(0.5mg/kg)经卵清蛋白致敏14天后,最后一次OVA雾化结束后24h,收集BALF进行细胞计数和分类,测定BALF中IL-10和TGF-β1;流式细胞检测Th1、Th2、Treg比例;H-E染色观察肺组织炎症改变;用免疫组化方法检测肺组织TGF-β1的表达;原位杂交方法检测肺组织AMcase mRNA;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量测定肺组织内TGF-β1、AMCase、TARC、MDC、NF-κB、STAT1和C-jun mRNA表达。结果几丁质酶抑制剂组较哮喘组小鼠气道炎症明显减轻,BALF中嗜酸性粒细胞明显减少,TGF-β1、STAT1 mRNA的表达显著降低;BALF中IL-10水平和脾单核细胞中Treg细胞比例明显提高,C-jun mRNA的表达增加。结论几丁质酶抑制剂可促进Treg细胞表达,降低肺组织TGF-β1和STAT1 mRNA的表达,提高肺组织C-jun mRNA的表达,在一定程度上减轻哮喘小鼠的气道炎症。第三部分酸性哺乳动物几丁质酶mRNA表达及其影响因素探讨目的观察人支气管上皮细胞(HBE)酸性哺乳动物几丁质酶(AMCase)表达特点,及几丁质微粒(CMP)和布地奈德的影响。方法HBE细胞分别与细胞因子共同孵育2、4、8、16、24,48和72小时。HBE细胞分别与细胞因子和干预剂CMP、布地奈德共同孵育24小时。用Realtime PCR方法测定HBE细胞AMCase mRNA表达;结果IL-13刺激HBE 24小时AMCase mRNA表达未见明显变化。IL-4刺激HBEAMCase mRNA表达呈波浪样变化,在48h表达为一高峰,在2h存在一小峰值,但于刺激后72小时,AMCase mRNA的表达却明显降低,几乎接近刺激前的基因表达水平。TNF-α、Der P1、IL-13+Der P1和IL-4+Der P1刺激对HBE AMCase mRNA表达,随着时间延长,其表达逐渐升高;Der P1在刺激4h,IL-4+Der P1在刺激2h表达有一峰值。CMP可促进IL-13+Der P1和IL-4+Der P1诱导HBE表达AMCasemRNA,该作用可被布地奈德逆转,又可降低HBE AMCase mRNA表达。结论IL-4、TNF-α、Der P1和CMP可直接作用于支气管上皮细胞促进AMCase mRNA。糖皮质激素可降低AMCase mRNA表达。第四部分AMCase对人支气管上皮细胞TARC、TGF-β1、ICAM-1mRNA表达的影响目的观察人支气管上皮细胞(HBE)AMCase对TARC、TGF-β1、ICAM-1 mRNA表达的影响。方法应用RNA干扰技术,HBE和RNAiHBE细胞分别与细胞因子共同孵育24小时,观察AMCase干扰前后TARC、TGF-β1、ICAM-1 mRNA表达的变化。用Realtime PCR方法测定细胞AMCase mRNA表达。用Western方法检测细胞浆内IκBα。结果AMCase干扰后,TGF-β1表达明显增高,sICAM-1 mRNA表达有增多趋势。结论AMCase对人支气管上皮细胞TGF-β1、ICAM-1表达可能有负性影响。