发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国发现的一种新发传染病病毒,可引起人类严重发热伴血小板减少综合征。2010年以来,在我国湖北、安徽、山东等地相继报道了以发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病病例,其中少数重症患者可因多脏器损害,救治无效死亡。我国研究人员从患者血清标本中分离到了该种病毒,经全基因组序列分析证实该病毒是一种新型布尼亚病毒。目前关于新布尼亚病毒的基因序列调控元件以及非编码区功能尚不明确,有待进一步研究。微复制子是近年发展起来的一种反向遗传技术,目前已应用于多种布尼亚病毒基因功能的研究中,为SFTS布尼亚病毒的研究提供了新的研究思路。微复制子是以报告基因替换病毒的编码序列,保留非编码序列,结构简单,易于构建,操作方便,通过定向缺失、插入等基因操作对其序列进行突变,可用于目的基因功能表达调控的研究。SFTS布尼亚病毒为分节段负链RNA病毒,基因组包括大(L)、中(M)、小(S)三个片段。L片段全长6368个核苷酸,含有一个自cRNA5’端17～6271位核苷酸的开放读码框,M片段全长3378个核苷酸,含有一个自cRNA5’端19～3240位核苷酸的开放读码框,S片段长1744个核苷酸,属双义RNA,有两个方向相反的读码框。因此,L、M、S三个片段5’和3’末端均存在16～138个核苷酸长短不等的非编码区(NCRs)。布尼亚科病毒基因组中非编码序列含有调控病毒转录、复制和包装的信息,本研究拟利用L、M、S片段的非编码序列建立SFTS布尼亚病毒的微复制子系统,并比较三个片段非编码区的启动子强度。RNA聚合酶Ⅰ广泛存在于所有真核细胞中,在实验过程中不必额外提供DNA依赖的RNA聚合酶,已成功应用于布尼亚病毒的反向遗传研究中。因此本研究选用RNA聚合酶Ⅰ体系构建SFTS布尼亚病毒微复制子系统。首先,我们分别以绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶为报告基因,替换HB29株SFTS布尼亚病毒的L、M、S片段的编码序列,将不同的PCR扩增产物连接至pGEM-Teasy载体中,通过双酶切法进行片段重组,获得包含病毒5’和3’末端非编码区以及报告基因的嵌合序列。然后将此嵌合片段反向克隆至具有polⅠ启动子的载体pHH21中,构建SFTS布尼亚病毒的微复制子报告质粒,包括以绿色荧光蛋白为报告基因的报告质粒L-GFP-pHH2、M-GFP-pHH2、S-GFP-pHH21和以荧光素酶为报告基因的报告质粒L-Luc-pHH2、M-Luc-pHH21和S-Luc-pHH21。由基因组RNA、L蛋白和N蛋白共同形成核糖核蛋白(RNP),是负链RNA病毒转录复制的最小功能单位。本研究以SFTS辅助病毒感染或者质粒共转染的方式研究微复制子功能。我们以MOI=1PFU/细胞病毒感染SFTS布尼亚病毒敏感细胞系Vero细胞,7天后间接免疫荧光法检测染毒情况,并以荧光定量PCR方法检测感染细胞的病毒量。通过辅助病毒感染,在细胞中产生病毒RNA依赖的RNA聚合酶和核蛋白,然后转染L、M、S片段GFP报告质粒,荧光显微镜下观察绿色荧光。结果显示,抗原片阳性率达80%,病毒量为104拷贝数以上,转染后24h开始观察,无荧光出现。在其他布尼亚病毒微复制子系统中,已建立起由质粒表达L蛋白和N蛋白与报告质粒共转染的方法,为我们构建SFTS布尼亚病毒微复制子提供了思路。SFTS布尼亚病毒L蛋白和N蛋白真核表达质粒由王涛研究员构建表达,我们利用表达SFTSV的L蛋白和N蛋白的质粒VR1012-L和VR-1012-NP,与GFP报告质粒共同转染293T细胞,24h后观察荧光。结果显示L、M、S片段均可观察到特异性绿色荧光,荧光数目极少,L片段48h后荧光灶数目增多。将L、M、S片段非编码区嵌合荧光素酶报告基因的重组质粒,与L蛋白和N蛋白表达质粒共转染293T细胞,24h后裂解细胞,取少量上清检测荧光素酶活性。结果显示,L、M、S片段有不同水平本底表达,共转染组荧光素酶活性显著高于对照,L、M、S不同片段之间表达水平的存在差异,其中嵌入M片段5’和3’末端非编码区的荧光素酶表达量高于嵌入L片段5’和3’末端非编码区的荧光素酶表达量,而后者又高于嵌入S片段的5’和3’末端非编码区的荧光素酶表达量。综上所述,本研究建立了SFTS布尼亚病毒微复制子系统。L、M、S片段非编码区序列均有启动微复制子转录和复制的功能,然而强度不同,M片段非编码区启动子强度高于L和S,S片段非编码区启动子最弱。在SFTSV微复制子基础上,可以突变或缺失三个基因片段的非编码区进行改造,进一步探索病毒基因非编码区序列的功能,研究布尼亚病毒的转录、复制机制。