研究背景MAPK-JNK信号通路在细胞增殖、分化、运动及凋亡等多种生理过程中发挥着重要的调节作用。JIP家族(JNK-interacting protein family)在哺乳动物中有4个成员,包括JIP1、JIP2、JIP3和JIP4,他们都具有高度保守的JNK结合域,均在JNK信号通路激活过程中发挥促进作用。其中,JIP3最早是作为JNK3的结合蛋白被发现的。进一步的研究则证实JIP3与JNK1,JNK2也有结合,但与JNK3的结合更强。JIP3与JNK的关系密切,其首先可以作为JNK信号通路的支架蛋白来增强JNK的激活;其次,其还可以作为JNK的底物,在被JNK磷酸化后接受JNK的调控。另一方面,在线虫中JIP3的同源异构体UNC-16和果蝇中JIP3的同源异构体syd与驱动蛋白结合,作为运输货物的调控蛋白,参与货物的轴突运输。而在哺乳动物细胞中,JIP3也可以通过单独或与JIP1合作的方式共同介导胞内货物的轴突运输。综合以上细胞生物学水平的研究,我们了解到JIP3在细胞内主要调节JNK信号通路的激活以及胞内货物的运输。那么其在动物的组织水平上发挥什么样的的功能呢?首先,最近的一些研究证实JIP3对于个体发育十分重要:比如有研究检测到JIP3在胚胎期第9-10天即开始有微弱的表达,到胚胎期第13天其表达明显升高,这提示JIP3可能参与神经系统的发育。而早在2003年Kelkar等人即利用同源重组方式敲除JIP3第1号外显子,从而破坏JIP3基因表达,发现JIP3-/-小鼠出生后致死,组织切片染色后观察发现端脑连接缺失以及神经元排列无序。这再次验证了 JIP3参与了小鼠的发育过程。为了缩小敲除JIP3的损伤,2007年Tronche等人采用Nestin-cre工具鼠与JIP3Flox/Flox杂交,发现在中枢神经系统敲除JIP3也导致了出生后致死,端脑连接缺失。以上研究均证实JIP3对于小鼠的发育,特别是对大脑的发育具有至关重要的作用。更有意思的是,研究已证实在成年小鼠中JIP3在脑中的表达明显高于其他器官,这提示JIP3在小鼠成年后的大脑中可能也发挥着重要作用。但是因为之前尝试获得成年JIP3敲除小鼠的努力均因小鼠发育异常导致的新生鼠致死而告失败,所以目前对于JIP3在成年期小鼠中的功能研究尚无任何进展。对于JIP3在成年期小鼠中功能的揭示,将为我们更加全面的理解JIP3的功能发挥重要作用。大脑是一个由多个功能性脑区有机组合而形成的一个精密组织,这些脑区既有功能分工,又在功能上相互制约,相互联系,共同发挥着调控大脑功能的作用。海马脑区作为主要负责认知、学习记忆及情绪的重要脑区。在解剖学层次上,海马可以分为CA1,CA3和DG,它们构成神经环路共同行使海马功能。我们的研究发现,JIP3在成年小鼠的海马脑区,尤其是海马的CA1及DG的突触形成部分集中分布,并且在兴奋性神经元和抑制性神经元中均有分布,提示其与该部分脑区的功能有关。进一步的,我们检测了正常小鼠在经过条件性恐惧记忆和水迷宫训练之后的表达变化情况,结果发现在小鼠在经过上述两种行为学范式训练之后,其背侧海马中JIP3的表达明显升高,而腹侧海马的JIP3表达量则无变化,这提示JIP3参与了海马依赖的学习记忆过程。为了证实JIP3是海马依赖的学习记忆的必要条件,我们采用脑立体定位注射在小鼠的海马脑区注射JIP3的干扰病毒实验研究其是否影响成年小鼠的学习记忆情况。结果发现,干扰JIP3病毒注射后,小鼠的条件性恐惧记忆能力及空间学习记忆能力都受损了,这提示JIP3对于小鼠海马依赖的学习记忆能力是必须的。考虑到病毒注射的有创性及精准性不足的缺点,我们已制作完成JIP3的条件性敲除小鼠,下一步拟利用该小鼠与相应Cre老鼠杂交,进一步证实JIP3对于海马依赖学习记忆的作用。目的:探究JIP3是否影响成年小鼠的学习记忆行为。方法:1、蛋白提取及蛋白免疫印迹实验取小鼠不同脑区的组织样本,经过蛋白裂解后提取蛋白并通过免疫印迹方法进行检测,最后用软件Quantity One进行统计分析。2、免疫组织化学染色在JIP3不同脑区分布的研究中,我们首先用5%的水合氯醛深度麻醉成年小鼠,依次经过生理盐水冲洗和4%多聚甲醛固定,进一步的后固定和蔗糖脱水。脑经过冠状切用于免疫组织化学染色,JIP3抗体浓度为1:500。最后在荧光显微镜下拍照。3、免疫细胞化学染色在JIP3在哪种类型细胞中分布的研究中,我们首先体外培养海马神经元,接下来进行免疫细胞化学染色,JIP3、Camkii、Gad67一抗浓度均为1:200,最后在倒置荧光显微镜下拍照。4、脑立体定位和病毒微量注射5%水合氯醛腹腔注射到小鼠体内,麻醉后固定在脑立体定位仪上。选择背侧海马注射病毒,注射的坐标为:后1.82毫米,左右±1.5毫米,深度-2.5毫米。5、行为学测试5.1旷场实验为检测小鼠的自主运动能力和是否产生焦虑样行为。将小鼠放在旷场中央区,用Smart软件记录小鼠在旷场中10分钟的自由活动情况,分析这10分钟总的运动距离来评价小鼠自主运动能力,分析在中央区时间的比例来作为评价小鼠焦虑样行为的指标。5.2条件性恐惧记忆为检测JIP3干扰病毒是否影响小鼠的恐惧记忆。在训练小鼠足底电击刺激产生的恐惧记忆后24小时,再检测小鼠在无电击刺激的情况下的不动时间来作为检测小鼠恐惧记忆能力的指标。5.3水迷宫将小鼠放有四个象限的水池中,每天训练四个象限各一次,共训练5天。在第6天,撤掉平台,检测小鼠在目的象限中停留的时间以及穿梭的次数来评价小鼠空间学习记忆能力。6、JIP3条件性干扰小鼠的制作及鉴定按照文献的方法及分子克隆技术制作插入片段,然后交由上海同济大学动物中心制作JIP3条件性敲除小鼠。小鼠出生后首先通过PCR鉴定鼠尾基因组中外源片段的插入情况,然后再待其成年后与Emx-1-Cre小鼠杂交,利用蛋白免疫印迹测定其阳性子代脑组织蛋白中JIP3的表达变化情况。另外,我们还进一步通过尼氏染色及脑体积观察分析了 JIP3条件性敲除小鼠的形态变化。结果:1、JIP3在成年小鼠海马的CA3和DG脑区的兴奋性和抑制性神经元中有大量分布为了研究JIP3在成年小鼠脑中的功能,我们首先提取了包括皮层、海马、中脑和小脑在内的几个主要的脑区组织样本的裂解液,然后通过蛋白免疫印迹的方法检测不同脑区中JIP3的表达情况。结果证实JIP3在几个脑区中均有表达,但在海马中的表达明显高于其他脑区。接下来我们又通过免疫组织化学染色的方法检测了 JIP3在海马各亚脑区的分布情况,结果表明JIP3主要集中在CA3、DG亚区突触形成的部位。最后我们通过免疫细胞化学染色检测到JIP3在CaMKII阳性的兴奋性神经元及GAD67阳性的抑制性神经元中均有分布。上述结果证实JIP3主要分布在成年小鼠海马的CA3和DG脑区的兴奋性和抑制性神经元中,提示其与海马依赖的动物行为可能存在一定的关系。2、JIP3参与背侧海马恐惧记忆和空间记忆为了检测JIP3是否参与,以及参与了哪些海马依赖的动物行为过程,我们首先利用正常小鼠进行足底电击的恐惧性记忆训练,然后利用蛋白免疫印迹的方法检测JIP3的表达是否发生变化。结果表明背侧海马中的JIP3在训练后有明显升高,而腹侧海马的JIP3没有变化。这个结果提示JIP3可能参与海马依赖的学习记忆行为。在此基础之上,我们进一步采用了另外一种海马依赖学习记忆范式水迷宫实验对该现象进行了验证。结果发现在训练三天后,JIP3在背侧海马的表达同样有明显升高,证实了 JIP3参与了海马依赖的学习记忆。3、JIP3对于海马依赖的学习记忆是必须的为了检测JIP3在海马依赖的学习记忆的必要性,我们通过在小鼠背侧海马中注射JIP3干扰病毒来检测JIP3表达降低后对小鼠学习记忆产生了什么样的影响。在包好干扰JIP3的慢病毒之后,我们利用脑立体定位注射将病毒打入小鼠的背侧海马JIP3表达丰富的CA3和DG脑区中间,在这两个亚脑区同时降低JIP3的表达。在病毒表达两周后,我们利用这些动物进行动物行为学测试。首先我们通过旷场实验检测了打入病毒后是否影响小鼠的自主运动能力和情绪,结果证实打入干扰JIP3的病毒不影响小鼠的运动能力和情绪。在此基础之上,我们又通过条件性恐惧记忆和水迷宫两个行为学范式检测了小鼠的学习记忆能力是否受JIP3干扰的影响。结果表明,CA3和DG脑区干扰JIP3将损伤小鼠的恐惧学习记忆能力和空间学习记忆能力,提示JIP3对于海马依赖的学习记忆行为是必须的。4、条件性干扰JIP3转基因小鼠的制备及鉴定因为JIP3敲除鼠包括全身敲和局部脑区敲除都出现了小鼠出生致死的现象,使得无法研究成年期的功能。因此,我们采取在特定脑区条件性干扰JIP3的表达的方法,获得了可正常发育到成年的JIP3敲除小鼠,从而使得进一步研究JIP3在成年期的功能成为了可能。结论:1、JIP3在海马CA3和DG脑区的兴奋性和抑制性神经元中广泛分布。2、JIP3参与小鼠海马依赖的学习记忆行为。3、JIP3对于小鼠海马依赖的学习记忆行为是必须的。创新点:1、首次证实JIP3在成年小鼠中参与海马依赖的学习记忆行为2、首次获得了可正常发育至成年的JIP3条件性干扰小鼠,使进一步研究JIP3在成年期的功能成为了可能。